Zelluläre Migration ist ein kritischer Wundheilungsprozess, der das Ergebnis einer heilenden Wunde drastisch verändern kann. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Wirkung verschiedener Verbindungen auf die zelluläre Migration während der Wundheilung besser zu verstehen. Was oft zu gezielten Behandlungsstrategien für die klinische Medizin führen kann.
Der Scratch-Assay ist ein kostengünstiger und hochdurchsatzhoher Ansatz zur Generierung aussagekräftiger Wundheilungsdaten vor kostspieligen und zeitintensiven In-vivo-Tests. Der Kratztest als Methode ist besonders bei Wundheilungsanwendungen relevant. Am spezifischsten die Haut.
Der Test ist jedoch wirklich ein Migrationstest und könnte auf jeden Zelltyp angewendet werden, bei dem die Migration von Zellen für die Messung oder Erfassung von Interesse ist. Ähnlich wie klassische Zell- und Gewebekultur, Standard-Operationsverfahren, Training, Technik und Praxis, Praxis, Praxis. Diese sind der Schlüssel zum Erfolg mit dem Scratch-Assay.
Das Verfahren wird Nathan Cruz, ein Master-Student, und Oscar Lujan, ein Student des Bachelor-Studiums, demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie den Biosafety II Schrank mit einer 70%isopropyl wässrigen Lösung vor, um ein Sanitärtuch durchzuführen, beginnend an der Rückseite und Seitenwände, und bis zur Grundplatte zu arbeiten. Wischen Sie auch alle Materialien ab, die im Test verwendet werden, bevor Sie sie in den Schrank legen.
Als nächstes erhalten Sie Fläschchen mit der gewünschten kryokonservierten Zelllinie und legen Sie eines in ein ein Zentimeter tiefes Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um aufzutauen. Fügen Sie 10 Milliliter Medium mit 10%FBS in einen T75 Gewebekulturkolben ergänzt. Öffnen Sie die Durchstechflasche mit dem Zellstock, und saugen Sie die Lösung sorgfältig an.
Dann übertragen Sie die Zellen in den T75-Kolben. Entfernen Sie einen Milliliter Medien aus dem Kolben, und übertragen Sie ihn wieder in die Durchstechflasche, und übertragen Sie ihn dann wieder in den Kolben, um die Zellausbeute aus der Durchstechflasche zu maximieren. Ziehen Sie die Kappe des Kolbens fest und schaukeln Sie ihn sanft, um die Zellen in Suspension gleichmäßig über die gesamte Oberfläche zu verteilen.
Danach beschriften Sie den Kolben mit den hier gezeigten Informationen und legen ihn 72 Stunden lang in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Rufen Sie zunächst den Gewebekulturkolben aus dem Inkubator ab, und beobachten Sie die im Textprotokoll beschriebenen haftenden Zellen. Saugen Sie das gesamte Medienvolumen aus dem Kolben und übertragen Sie es in einen Abfallbehälter.
Fügen Sie dem Kolben fünf Milliliter ausgewogene Salzlösung hinzu und schaukeln Sie ihn sanft, um überschüssige Medien, abgestorbene Zellen oder Abfallprodukte auszuspülen. Dann das gesamte Volumen der Salzlösung aus dem Kolben entfernen und in einen Abfallbehälter entsorgen. Als nächstes fügen Sie dem Kolben zwei Milliliter Trypsin hinzu und schaukeln Sie ihn sanft, um das Enzym über die haftenden Zellen zu verteilen.
Stellen Sie sicher, dass die anhantibe Oberfläche vollständig gesättigt ist, und legen Sie den Gewebekolben für zwei bis drei Minuten in den Inkubator. Tippen Sie danach drei- bis fünfmal vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um die Zellablösung zu erleichtern. Wischen Sie den Kolben mit 70% Alkohol ab und legen Sie ihn in den Biosicherheitsschrank.
Fügen Sie dem Gewebekolben fünf Milliliter Stoffmedien hinzu, um die Enzymsubstratreaktion zu stoppen. Das gesamte Flüssigkeitsvolumen aus dem Kolben absaugen und in ein steriles 15-Milliliter-Konusrohr geben. Zentrifuge bei 200 mal g und bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten.
Verwenden Sie dann 70% Alkohol, um die Röhre mit den pelletierten Zellen abzuwischen und in den Biosicherheitsschrank zu legen. Pipette aus dem Medium, hinterlässt etwa 250 Mikroliter Flüssigkeit mit dem Zellpellet. Führen Sie den Boden des konischen Rohres über die Durchstechflasche eines Mikrozentrifugenrohrgestells, um eine schnelle Vibration zu erzeugen und das Zellpellet zu stören und wieder aufzuhängen.
Wenn die neue Zelllösung korrekt abgeschlossen ist, erscheint sie als trübe Mischung ohne verbleibendes Pellet. Fügen Sie der Zellresuspension zwei Milliliter Medien hinzu. Pipette die Zellen sanft auf und ab der Seite des Rohres 20 Mal, um alle Klumpen zu brechen.
Und zeichnen Sie das gesamte Zellsuspensionsvolumen auf. Als nächstes verwenden Sie eine sterile Pipette, um 20 Mikroliter Trypan-Blau-Lager zu einem leeren Brunnen einer 96-Well-Platte hinzuzufügen. Mit einer sterilen Pipettenspitze 20 Mikroliter Zellstock aus dem 15-Milliliter-Rohr in den Brunnen mit der Trypan-Blaulösung geben.
Rohrleitung sanft, um den Inhalt zu mischen und übertragen 10 Mikroliter der Mischung zwischen dem Deckel-Schlupf und der Zählkammer auf einem Hämozytometer. Zählen Sie nur die Zellen in der Mitte und vier Eckquadrate, und zählen Sie sowohl die Gesamtzellenzahl als auch die nicht lebensfähige Zellzahl für die fünf identifizierten Quadrate separat. Markieren Sie nach der Berechnung der lebensfähigen Zellzahl eine horizontale Linie über den Boden einer 12-Well-Platte, um während der Bildgebung als Referenzzeichen zu dienen.
Verdünnen Sie den Zellbestand mit Medien auf eine Dichte von 19.000 Zellen pro Milliliter. Dann säen Sie jeden Brunnen der 12-Well-Platte mit einem Milliliter des verdünnten Zellbestandes, mischen Sie den Zellstock regelmäßig, um eine gleichmäßige Zellaussaat über alle 12 Brunnen zu gewährleisten. Beschriften Sie jede Platte mit den hier gezeigten Informationen.
Und legen Sie es in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, bis die Zellen zu 100% Zusammenfluss wachsen. Holen Sie sich eine 12-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator. Beobachten Sie mit einem Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv die Zellen und bestimmen Sie den Zusammenfluss in jedem Brunnen.
Als nächstes können Sie die Wachstumsmedien aus jedem Brunnen ansaugen und entsorgen. Montieren Sie einen P200 Pipetter mit einer 1-200 Mikroliter sterilen Spitze. Gleiten Sie in jedem Brunnen die Pipettenspitze über die Zelloberfläche von der 12:00-Position bis zum 6:00-Standort, um eine Kratzer-Mock-Wunde zu erzeugen.
Spülen Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter ausgewogener Salzlösung, um überschüssigen Schmutz und Zellklumpen zu entfernen. Schaukeln Sie die Platte von Seite zu Seite, um das Waschen zu erleichtern. Dann die ausgewogene Salzlösung von jedem Brunnen entfernen und entsorgen.
Mit einem P1000 Pipetter mit einer 1.000-Mikroliter-Spitze 1.000 Mikroliter aus den vorbereiteten Arsenbeständen in Brunnen geben, die zufällig mit einer Behandlungsgruppe zugeordnet wurden. Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze für jeden Brunnen, und notieren Sie die Zeit, zu der die Behandlungen hinzugefügt werden. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Um die Platten abzubilden, erfassen Sie Bilder von jedem Brunnen bei 10-facher Objektivvergrößerung alle vier Stunden über einen Zeitraum von 24 Stunden. Verweisen Sie auf die zuvor auf der Unterseite der Platte gezeichnete Linie, um die gleiche Position entlang des Kratzers in jedem Bohrwert an jedem Zeitpunkt abzubilden. In dieser Studie wird ein In-vivo-Scratch-Test-Test verwendet, um die Auswirkungen von Arsen auf die Zellmigration zu beobachten.
In allen Behandlungsgruppen werden gleichmäßige Kratzer mit einer mittleren Kratzbreite von etwa 0,8 Millimetern beobachtet. Die Kontrollzellen zeigen nach 20 Stunden einen vollständig geheilten Kratzer. Die beiden Arsengruppen zeigen diesen Heilungsgrad nicht.
Mit der 10-Mikromolaren-Behandlung, die den Verschluss insgesamt für 24 Stunden hemmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von Arsen die zelluläre Migration verlangsamt. Die während des Tests aufgenommenen Rohbilder werden mit automatisierter Software analysiert, um die Wundbreite zu messen, dann den prozentualen Verschluss zu berechnen und schließlich die Fläche unter der Kurve zu berechnen.
Die 10-Mikromolar-Behandlungsgruppe zeigt eine statistisch verlangsamte zelluläre Migration von humanen neonatalen dermalen Fibroblasten im Vergleich zu allen anderen Behandlungsgruppen. Es ist wichtig, diese Technik gründlich zu üben, um die Konsistenz beim Kratzen der Zellen zu erhöhen. Unbeabsichtigte Variabilität zwischen Assays kann Daten möglicherweise verzerren und Schlussfolgerungen ändern.
Weitere molekulare Techniken wie quantitative Polymerase-Kettenreaktion und enzymgebundene Immunsorbent-Assays können nach dem Kratzer-Assay eingesetzt werden, um Botensignale und Proteine zu identifizieren, die das Ziel für Veränderungen der Zellmigration sein können, die im Test beobachtet wurden. Dieser Test hat zum Verständnis der Forscher über Krebsmetastasen, neue aufkommende Krebstherapien, Stammzellen und regenerative Medizin und viele andere wissenschaftliche Meilensteine beigetragen.
