세포 이동은 치유 상처의 결과를 크게 바꿀 수있는 중요한 상처 치유 과정입니다. 이 프로토콜은 연구원이 상처 치유 도중 세포 이동에 각종 화합물의 효력을 더 잘 이해할 수 있게 합니다. 종종 임상 의학에 대 한 대상된 치료 전략으로 이어질 수 있습니다.
스크래치 분석법은 생체 내에서 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 결과전에 의미 있는 상처 치유 데이터를 생성하는 비용 효율적이고 높은 처리량 접근법입니다. 스크래치 분석법은 특히 상처 치유 응용 분야에서 관련이 있습니다. 가장 구체적으로, 피부.
그러나, 분석은 실제로 마이그레이션 분석이고, 세포의 이동이 측정하거나 포착하기 위하여 관심 있는 모든 세포 모형에 적용될 수 있었습니다. 고전적인 세포 및 조직 배양과 유사, 표준 수술 절차, 훈련, 기술, 연습, 연습. 이는 스크래치 분석과 함께 성공의 열쇠입니다.
절차를 시연하는 것은 석사 과정 학생인 네이선 크루즈와 학부 연구원인 오스카 루잔(Oscar Lujan)이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 70%의 이소프로필 수성 용액을 사용하여 생체 안전 II 캐비닛을 준비하여 후면 벽과 측면 벽에서 시작하여 베이스 플레이트로 작업하는 위생 물티슈를 수행합니다. 또한 캐비닛에 넣기 전에 분석에 사용되는 모든 재료를 닦아냅니다.
다음으로, 원하는 냉동 보존 세포수를 포함하는 바이알을 얻고, 해동하기 위해 섭씨 37도에서 1센티미터 깊이의 수조에 1개를 놓습니다. T75 조직 배양 플라스크에 10%의 FBS로 보충된 10밀리리터의 매체를 추가합니다. 셀 스톡이 포함된 바이알을 열고 용액을 조심스럽게 흡인시합니다.
그런 다음 세포를 T75 플라스크로 옮킨다. 플라스크에서 1밀리리터의 미디어를 제거하고 바이알로 다시 옮은 다음 플라스크로 다시 전송하여 유리병으로부터 세포 수율을 최대화합니다. 플라스크의 캡을 조이고 부드럽게 흔들어 전체 표면에 걸쳐 현탁액의 세포를 균일하게 분산시합니다.
그런 다음 플라스크에 표시된 정보를 라벨로 표시하고 72시간 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 가습된 인큐베이터에 놓습니다. 먼저, 인큐베이터로부터 조직 배양 플라스크를 회수하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 부착된 세포를 관찰한다. 플라스크에서 전체 양의 미디어를 흡인하여 폐기물 용기로 옮기습니다.
플라스크에 균형 잡힌 소금 용액 5밀리리터를 넣고 부드럽게 흔들어 과도한 매체, 죽은 세포 또는 폐기물을 헹구십시오. 그런 다음 플라스크에서 소금 용액의 전체 볼륨을 제거하고 폐기물 용기에 버려십시오. 다음으로, 플라스크에 트립신 의 두 밀리리터를 추가하고 부드럽게 흔들어 부착 된 세포에 효소를 분산시.
부착 된 표면이 완전히 포화되었는지 확인하고 조직 플라스크를 인큐베이터에 2 ~ 3 분 동안 배치하십시오. 그 후 플라스크 의 측면을 3~5회 가볍게 탭하여 세포 분리를 용이하게 합니다. 플라스크를 70% 알코올로 닦아 생물 안전 캐비닛에 놓습니다.
효소 기판 반응을 중지 하는 조직 플라스크에 스톡 미디어의 5 밀리 리터를 추가 합니다. 플라스크에서 전체 양의 액체를 흡인하고 멸균 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기십시오. 원심분리기는 200배, 섭씨 25도에서 5분간.
그런 다음 70%의 알코올을 사용하여 펠릿 세포를 포함하는 튜브를 닦아 생물 안전 캐비닛 내부에 놓습니다. 파이펫은 세포 펠릿을 가진 액체의 대략 250 마이크로리터를 남겨두고, 매체에서 떨어져 둡트합니다. 마이크로센심분리기 튜브 랙의 유리병에 걸쳐 원적 튜브의 바닥을 실행하여 신속한 진동을 일으키고 세포 펠릿을 방해하고 재보펜합니다.
올바르게 완료되면 새 셀 용액이 남은 펠릿이 없는 흐린 혼합물로 나타납니다. 셀 리서스펜션에 2밀리리터의 미디어를 추가합니다. 튜브의 측면을 부드럽게 위아래로 피펫하여 덩어리를 분해합니다.
그리고 총 셀 서스펜션 볼륨을 기록한다. 다음으로 멸균 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 빈 우물에 트라이판 블루 스톡 20 마이크로리터를 추가합니다. 멸균 파이펫 팁을 사용하여 15 밀리리터 튜브에서 트라이팬 블루 용액을 함유한 우물로 20 마이크로리터의 셀 스톡을 전달합니다.
파이펫은 내용물의 혼합을 부드럽게 혼합하고 혈우세포계에 커버 슬립과 계주 챔버 사이에 혼합물의 10 마이크로리터를 전송합니다. 중앙및 4개의 코너 사각형에 있는 세포만 계산하여, 확인된 5개의 사각형에 대한 총 세포 수와 실행 불가능한 셀 수를 따로 집계합니다. 실행 가능한 셀 수를 계산한 후 이미징 중에 참조 마크역할을 하기 위해 12웰 플레이트의 하단을 가로질러 수평 선을 표시합니다.
밀리리터당 19, 000 세포의 밀도로 매체로 세포 육수를 희석합니다. 그런 다음 희석 된 세포 육수의 1 밀리리터로 12 웰 플레이트의 각 우물을 시드하여 세포 재고를 주기적으로 혼합하여 12 개의 우물전체에 걸쳐 세포 를 시동하십시오. 여기에 표시된 정보와 함께 각 접시에 레이블을 지정합니다.
그리고 세포가 100 %의 합류로 자랄 때까지 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %의 인큐베이터에 놓습니다. 인큐베이터에서 셀이 있는 12웰 플레이트를 검색합니다. 10x 목표를 가진 현미경을 사용하여 세포를 관찰하고 각 우물 내의 합류를 결정합니다.
다음으로, 각 우물에서 성장 매체를 흡인하고 처분합니다. 1-200 마이크로리터 멸균 팁으로 P200 파이프터를 조립합니다. 각 우물에서, 스크래치 모의 상처를 생성하기 위해 12:00 위치에서 6:00 위치로 셀 표면을 가로 질러 파이펫 팁을 글라이드.
균형 잡힌 소금 용액 1밀리리터로 각각 잘 헹구어 과도한 파편과 세포 덩어리를 제거합니다. 접시를 좌우로 흔들어 세탁을 용이하게 합니다. 그런 다음 각 우물에서 균형 잡힌 소금 용액을 제거하고 폐기하십시오.
1, 000 마이크로리터 팁이 있는 P1000 피프터를 사용하여 준비된 비소 주식에서 1, 000 마이크로리터를 치료 그룹과 무작위로 할당된 우물에 추가합니다. 각 웰에 대해 새 파이펫 팁을 사용하고 처리가 추가되는 시간을 기록합니다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
플레이트를 이미지화하려면 24시간 동안 4시간마다 10배 의 객관적 배율로 각 우물의 이미지를 캡처합니다. 플레이트 의 하단에 이전에 그려진 선을 참조하여 각 시간 지점에서 각 우물 내의 스크래치를 따라 동일한 위치를 이미지합니다. 이 연구에서는 생체 내 스크래치 테스트 분석이 세포 이동에 대한 비소의 효과를 관찰하는 데 사용됩니다.
균일 한 스크래치는 약 0.8 밀리미터의 평균 스크래치 폭으로 모든 치료 그룹에서 관찰됩니다. 대조군 세포는 20시간 후에 완전히 치유된 스크래치를 보여줍니다. 두 비소 그룹은 치유의이 수준을 표시하지 않습니다.
10 마이크로 몰러 처리로 24 시간 동안 완전히 폐쇄를 억제합니다. 이러한 결과는 비소의 존재가 세포 이동을 느리게 한다는 것을 보여줍니다. 분석 중에 캡처된 원시 이미지는 자동화된 소프트웨어를 사용하여 상처 너비를 측정한 다음 백분율 클로저를 계산한 다음 마지막으로 곡선 아래 영역을 계산합니다.
10-micromolar 처리 단은 그밖 모든 처리 단에 비교된 인간 신생아 진피 섬유아세포의 통계적으로 둔화된 세포 이동을 보여줍니다. 세포를 긁을 때 일관성을 높이기 위해이 기술을 철저히 연습하는 것이 중요합니다. 분석 간의 의도하지 않은 가변성은 잠재적으로 데이터를 왜곡하고 결론을 변경할 수 있습니다.
정량적 중합체 연쇄 반응 및 효소-연결된 면역소벤트 분석과 같은 추가 분자 기술은 분석에서 관찰된 세포 이동에 대한 변화를 위한 표적이 될 수 있는 메신저 신호 및 단백질을 식별하기 위해 스크래치 후 분석법을 사용할 수 있다. 이 분석은 암 전이, 새로운 신흥 암 치료, 줄기 세포 및 재생 의학 및 기타 많은 과학적 이정표에 대한 연구원의 이해에 기여했습니다.
