La migrazione cellulare è un processo critico di guarigione delle ferite che può alterare drasticamente l'esito di una ferita curativa. Questo protocollo consente ai ricercatori di comprendere meglio l'effetto di vari composti sulla migrazione cellulare durante la guarigione delle ferite. Che spesso può portare a strategie di trattamento mirate per la medicina clinica.
Il test scratch è un approccio economico e ad alta produttività per generare dati significativi sulla guarigione delle ferite prima di test in vivo costosi e dispendiosi in termini di tempo. Il saggio scratch come metodo è particolarmente rilevante nelle applicazioni di guarigione delle ferite. Più specificamente, la pelle.
Tuttavia, il saggio è in realtà un saggio di migrazione, e potrebbe essere applicato a qualsiasi tipo di cella in cui la migrazione delle cellule è interessante da misurare o da catturare. Simile alla classica coltura cellulare e tissutale, alle procedure operative standard, all'allenamento, alla tecnica e alla pratica, alla pratica, alla pratica. Questi sono la chiave del successo con il test scratch.
A dimostrare la procedura saranno Nathan Cruz, uno studente di master, e Oscar Lujan, un ricercatore universitario. Per iniziare questa procedura, preparare l'armadio biosicurezza II utilizzando una soluzione acquosa isopropile al 70% per eseguire una salvietta igienica, a partire dalle pareti posteriori e laterali e lavorando fino alla piastra di base. Pulire anche tutti i materiali che verranno utilizzati nel saggio prima di metterli nell'armadio.
Quindi, ottenere fiale contenenti la linea cellulare crioconservata desiderata e posizionarne una in un bagno d'acqua profondo un centimetro a 37 gradi Celsius per scongelarsi. Aggiungere 10 millilitri di mezzo integrati con 10%FBS in un pallone da coltura tissutale T75. Aprire il flaconcino contenente il materiale cellulare e aspirare con cura la soluzione.
Quindi trasferire le cellule nel pallone T75. Rimuovere un millilitro di supporto dal pallone e trasferirlo di nuovo nel flaal, quindi trasferirlo di nuovo nel pallone per massimizzare la resa cellulare dal flaal. Stringere il cappuccio del pallone e scuoterlo delicatamente per disperdere uniformemente le cellule in sospensione su tutta la superficie.
Successivamente, etichettare il pallone con le informazioni mostrate qui e posizionarlo in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore. In primo luogo, recuperare il pallone di coltura tissutale dall'incubatore e osservare le cellule aderenti come delineato nel protocollo di testo. Aspirare l'intero volume di supporti dal pallone e trasferirlo in un contenitore di rifiuti.
Aggiungere cinque millilitri di soluzione salina bilanciata al pallone e scuoterlo delicatamente per risciacquare qualsiasi supporto in eccesso, cellule morte o prodotto di scarto. Quindi rimuovere l'intero volume di soluzione salina dal pallone e scartarlo in un contenitore di rifiuti. Successivamente, aggiungere due millilitri di tripina al pallone e scuoterlo delicatamente per disperdere l'enzima sulle cellule aderenti.
Assicurarsi che la superficie aderente sia completamente satura e posizionare il pallone di tessuto nell'incubatrice per due o tre minuti. Successivamente, toccare delicatamente il lato del pallone da tre a cinque volte per facilitare il distacco della cellula. Pulire il pallone con il 70% di alcol e posizionare nell'armadio per la biosicurezza.
Aggiungere cinque millilitri di mezzi stock al pallone tissutale per fermare la reazione del substrato enzimatico. Aspirare l'intero volume di liquido dal pallone e trasferirlo in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Centrifuga a 200 volte g e a 25 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi utilizzare il 70% di alcol per pulire il tubo contenente le cellule pellettate e posizionarlo all'interno dell'armadio per la biosicurezza. Pipetta fuori dal supporto, lasciando dietro di sé circa 250 microlitri di fluido con il pellet cellulare. Eseguire la parte inferiore del tubo conico attraverso le fessure del flaconcino di un rack per tubi a microcentrifugo per creare una vibrazione rapida e disturbare e rimescolare il pellet di cella.
Una volta completata correttamente, la nuova soluzione cellulare apparirà come una miscela torbosa senza pellet rimanente. Aggiungere due millilitri di supporto alla resospensione cellulare. Pipettare delicatamente le celle su e giù per il lato del tubo 20 volte per rompere eventuali grumi.
E registrare il volume totale delle sospensioni cellulari. Quindi, utilizzare una pipetta sterile per aggiungere 20 microlitri di calcio blu trypan a un pozzo vuoto di una piastra da 96 po '. Utilizzando una punta sterile di pipetta, trasferire 20 microlitri di calcio cellulare dal tubo da 15 millilitri al pozzo contenente la soluzione blu del trypan.
Pipettare delicatamente per mescolare il contenuto e trasferire 10 microlitri della miscela tra lo slittamento del coperchio e la camera di conteggio su un emocitometro. Contare solo le celle al centro e quattro quadrati d'angolo, sommando separatamente sia il conteggio totale delle celle che il conteggio delle celle non vitali per i cinque quadrati identificati. Dopo aver calcolato il conteggio delle celle vitali, contrassegnare una linea orizzontale sul fondo di una piastra da 12 poggia-porsi per fungere da segno di riferimento durante l'imaging.
Diluire il materiale cellulare con il supporto a una densità di 19.000 cellule per millilitro. Quindi seminare ogni pozzo della piastra da 12 pozzi con un millilitro del calcio cellulare diluito, mescolando periodicamente il calcio cellulare per garantire una semina uniforme delle cellule in tutti i 12 pozzi. Etichettare ogni piatto con le informazioni mostrate qui.
E posizionarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule non crescono al 100% di confluenza. Recuperare una piastra di 12 po 'con le celle dall'incubatore. Utilizzando un microscopio con un obiettivo 10x, osservare le cellule e determinare la confluenza all'interno di ogni pozzo.
Successivamente, aspirare e smaltire i mezzi di crescita da ogni pozzo. Assemblare un pipetter P200 con una punta sterile da 1-200 microliter. In ogni pozzo, scivolare la punta della pipetta attraverso la superficie della cella dalla posizione delle 12:00 alla posizione delle 6:00 per produrre una ferita finta di graffio.
Risciacquare ogni bene con un millilitro di soluzione salina bilanciata per rimuovere detriti in eccesso e ciuffi cellulari. Scuotere la piastra da un lato all'altro per facilitare il lavaggio. Quindi rimuovere e smaltire la soluzione salina bilanciata da ogni pozzo.
Utilizzando un pipetter P1000 con una punta da 1.000 microlitri, aggiungere 1.000 microlitri dalle scorte di arsenico preparate in pozzi che sono stati assegnati casualmente con un gruppo di trattamento. Utilizzare una nuova punta di pipetta per ogni pozzo e registrare l'ora in cui vengono aggiunti i trattamenti. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Per immagini le lastre, cattura le immagini di ogni pozzo con un ingrandimento obiettivo di 10 volte ogni quattro ore in un periodo di 24 ore. Fare riferimento alla linea precedentemente disegnata sul fondo della piastra per immaginere la stessa posizione lungo il graffio all'interno di ogni pozzo in ogni punto di tempo. In questo studio, un test di graffio in vivo viene utilizzato per osservare gli effetti dell'arsenico sulla migrazione cellulare.
Graffi uniformi si osservano in tutti i gruppi di trattamento, con una larghezza media dei graffi di circa 0,8 millimetri. Le cellule di controllo mostrano un graffio completamente guarito dopo 20 ore. I due gruppi arsenici non mostrano questo livello di guarigione.
Con il trattamento 10 micromolare che inibisce completamente la chiusura per 24 ore. Questi risultati dimostrano che la presenza di arsenico rallenta la migrazione cellulare. Le immagini grezze acquisite durante il test vengono analizzate utilizzando un software automatizzato per misurare la larghezza della ferita, quindi calcolare la chiusura percentuale e infine calcolare l'area sotto la curva.
Il gruppo di trattamento a 10 micromolari mostra una migrazione cellulare statisticamente rallentata dei fibroblasti dermici neonatale umani rispetto a tutti gli altri gruppi di trattamento. È importante praticare a fondo questa tecnica per aumentare la coerenza quando si graffiano le cellule. La variabilità involontaria tra i saggi può potenzialmente distorcere i dati e alterare le conclusioni.
Ulteriori tecniche molecolari come la reazione quantitativa a catena della polimerasi e i saggi immunoassorbenti legati agli enzimi possono essere utilizzate test post-graffio per identificare segnali messenger e proteine che possono essere il bersaglio per i cambiamenti nella migrazione cellulare osservati nel saggio. Questo saggio ha contribuito alla comprensione da parte dei ricercatori della metastasi tumorale, delle nuove terapie oncologiche emergenti, delle cellule staminali e della medicina rigenerativa e di molte altre pietre miliari scientifiche.
