Сотовая миграция является критическим процесс заживления ран, который может кардинально изменить исход заживления раны. Этот протокол позволяет исследователям лучше понять влияние различных соединений на клеточной миграции во время заживления ран. Что часто может привести к целенаправленным стратегиям лечения клинической медицины.
Анализ царапин является экономически эффективным и высокой пропускной способностью подход для создания значимых данных заживления ран до дорогостоящих и трудоемких in vivo тестирования. Анализ царапин как метод особенно актуален в приложениях для заживления ран. В частности, кожа.
Тем не менее, анализ действительно является миграционным анализом, и может быть применен к любому типу клеток, где миграция ячеек представляет интерес для измерения или захвата. Подобно классической клеточной и тканевой культуре, стандартным операционным процедурам, тренировкам, технике и практике, практике, практике. Это ключ к успеху с нуля анализа.
Демонстрация процедуры будет Натан Круз, студент магистратуры, и Оскар Луджан, студент исследователь. Чтобы начать эту процедуру, подготовить биобезопасность II кабинет с использованием 70%isopropyl aqueous решение для выполнения санитарии протрите, начиная с задней и боковой стенок, и работает до базовой панели. Также протрите все материалы, которые будут использоваться в анализе, прежде чем поместить их в шкаф.
Далее, получить флаконы, содержащие желаемую криоконсервированную линию клеток, и поместите один в один сантиметр-глубокую водяную ванну при 37 градусах по Цельсию, чтобы оттаять. Добавьте 10 миллилитров среды, дополненных 10%FBS, в колбу культуры ткани T75. Откройте флакон, содержащий клеточный бульон, и тщательно аспирировать раствор.
Затем перенесите клетки в колбу T75. Удалите один миллилитр мультимедиа из колбы и перенесите его обратно во флакон, а затем перенесите его обратно в колбу, чтобы максимизировать выход ячейки из флакона. Затяните крышку колбы и аккуратно потрясите ее, чтобы равномерно разогнать клетки в подвеске по всей поверхности.
После этого, этикетка колбу с информацией, показанной здесь, и поместите его во влажный инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 72 часов. Во-первых, извлекать колбу культуры тканей из инкубатора и наблюдать за прилипаемой клеткой, как указано в текстовом протоколе. Оспирировать весь объем средств массовой информации из колбы и передать его в контейнер для отходов.
Добавьте пять миллилитров сбалансированного соленого раствора в колбу и аккуратно потрясите его, чтобы промыть излишки мультимедиа, мертвые клетки или отходы. Затем удалите весь объем соленого раствора из колбы и выбросьте его в мусорный контейнер. Затем добавьте два миллилитров трипсина в колбу и аккуратно потрясите ее, чтобы разогнать фермент над прилипаемыми клетками.
Убедитесь, что поверхность адепта полностью насыщена, и поместите колбу ткани в инкубатор на две-три минуты. После этого осторожно коснитесь стороны колбы три-пять раз, чтобы облегчить отслоение клеток. Протрите колбу с 70% алкоголя, и поместите его в шкаф биобезопасности.
Добавьте пять миллилитров стоковых средств массовой информации в флябу ткани, чтобы остановить реакцию ферментного субстрата. Аспирировать весь объем жидкости из колбы, и передать его в стерильной 15-миллилитровой конической трубки. Центрифуга при 200 градусах г и при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Затем используйте 70% алкоголя, чтобы протереть трубку, содержащую гранулы клеток, и поместить его в шкаф биобезопасности. Pipette от средств массовой информации, оставив после себя около 250 микролитров жидкости с клеточной гранулы. Вы запустите дно конической трубки через флакон слоты микроцентрифуг трубки стойку, чтобы создать быструю вибрацию и беспокоить и повторно использовать ячейки гранулы.
После правильного завершения, новый клеточный раствор будет отображаться как облачная смесь без оставшихся гранул. Добавьте два миллилитров мультимедиа в повторное успение клетки. Pipette клетки мягко вверх и вниз по стороне трубки 20 раз, чтобы разбить любые сгустки.
И записывают общий объем подвески ячейки. Далее используйте стерильную пипетки, чтобы добавить 20 микролитров трипана синего бульона в пустой колодец из 96-хорошо пластины. Используя стерильный наконечник пипетки, перенесите 20 микролитров клеточного запаса из 15-миллилитровой трубки в колодец, содержащий трипановый синий раствор.
Пипетту аккуратно смешать содержимое и передать 10 микролитров смеси между крышкой скольжения и счетной камеры на гемоцитометре. Подсчитайте только ячейки в центре и четыре угловых квадрата, отдельно подсчитывая как общее количество ячеек, так и нежизнеспособность ячейки для пяти идентифицированных квадратов. После расчета жизнеспособного подсчета ячеев, отметь горизонтальную линию в нижней части пластины из 12 скважин, чтобы служить эталонным знаком во время визуализации.
Разбавить клеточный запас средствами массовой информации до плотности 19 000 клеток на миллилитр. Затем семя каждого колодца из 12-хорошо пластины с одним миллилитр разбавленного запасов клеток, смешивая запас клеток периодически, чтобы обеспечить даже посев клеток во всех 12 скважин. Наклеить этикетку каждой пластины с информацией, показанной здесь.
И поместите его в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе, пока клетки не вырастут до 100% слияния. Извлеки 12-хорошую пластину с клетками из инкубатора. Используя микроскоп с 10x целью, наблюдать клетки и определить слияние в каждой хорошо.
Далее, аспирировать и распоряжаться роста средств массовой информации из каждой хорошо. Соберите P200 pipetter с 1-200 микролитров стерильным наконечником. В каждой хорошо, скользить пипетки отзыв по поверхности клетки от 12:00 месте 6:00 месте производить царапины макет раны.
Промыть каждый колодец с одним миллилитров сбалансированного раствора соли, чтобы очистить избыток мусора и клеток сгустки. Рок пластины из стороны в сторону, чтобы облегчить стирку. Затем удалите и утилизировать сбалансированный раствор соли из каждой хорошо.
Используя P1000 pipetter с наконечником 1000 микролитров, добавьте 1000 микролитров из подготовленных запасов мышьяка в скважины, которые были случайным образом назначены с группой обработки. Используйте новый наконечник пипетки для каждого хорошо, и записывать время, когда лечение добавляются. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.
Чтобы изображение пластин, захватить изображения каждого хорошо в 10 раз объективное увеличение каждые четыре часа в течение 24-часового периода. Ссылка на линию, ранее нарисованную на нижней части пластины, чтобы изображение одного и того же местоположения вдоль нуля в каждой хорошо в каждой точке времени. В этом исследовании для наблюдения за воздействием мышьяка на миграцию клеток используется анализ теста in vivo.
Однородные царапины наблюдаются во всех группах лечения, со средним шириной царапины около 0,8 миллиметра. Контрольные клетки показывают полностью исцелил нуля после 20 часов. Две группы мышьяка не показывают такого уровня исцеления.
При 10-микромолярном лечении ингибирование замыкания вообще в течение 24 часов. Эти результаты показывают, что наличие мышьяка замедляет миграцию клеток. Необработанные изображения, сделанные во время анализа, анализируются с помощью автоматизированного программного обеспечения для измерения ширины раны, затем вычисляют процентное замыкание и, наконец, вычисляют область под кривой.
10-микромоляная группа лечения показывает статистически замедленную клеточную миграцию неонатальных фибробластов человека по сравнению со всеми другими группами лечения. Важно тщательно практиковать этот метод, чтобы увеличить последовательность при царапинах клеток. Непреднамеренная изменчивость между анализами потенциально может исказить данные и изменить выводы.
Дальнейшие молекулярные методы, такие как количественная полимераза цепная реакция и фермент связанных иммуносорбентов анализы могут быть использованы после царапины анализ для выявления посыльных сигналов и белков, которые могут быть мишенью для изменений в миграции клеток наблюдается в анализе. Этот анализ способствовал пониманию исследователями метастазов рака, новых новых методов лечения рака, стволовых клеток и регенеративной медицины, и многих других научных вех.
