La migración celular es un proceso crítico de cicatrización de heridas que puede alterar drásticamente el resultado de una herida curativa. Este protocolo permite a los investigadores comprender mejor el efecto de varios compuestos en la migración celular durante la cicatrización de heridas. Lo que a menudo puede conducir a estrategias de tratamiento dirigidas para la medicina clínica.
El ensayo de rasguños es un enfoque rentable y de alto rendimiento para generar datos significativos de cicatrización de heridas antes de costosas y costosas pruebas in vivo que requieren mucho tiempo. El ensayo de arañazos como método es particularmente relevante en aplicaciones de cicatrización de heridas. Más específicamente, la piel.
Sin embargo, el ensayo es realmente un ensayo de migración, y podría aplicarse a cualquier tipo de celda donde la migración de celdas sea de interés para medir o capturar. Similar al cultivo clásico de células y tejidos, procedimientos operativos estándar, entrenamiento, técnica y práctica, práctica, práctica. Esos son la clave del éxito con el ensayo de rasguños.
Demostrar el procedimiento estarán Nathan Cruz, un estudiante de maestría, y Oscar Lujan, un investigador de pregrado. Para comenzar este procedimiento, prepare el gabinete de bioseguridad II utilizando una solución acuosa 70%isopropilo para realizar una limpieza de saneamiento, comenzando en las paredes posterior y lateral, y trabajando hasta la placa base. También limpie todos los materiales que se utilizarán en el ensayo antes de colocarlos en el armario.
A continuación, obtenga viales que contengan la línea celular crioconservada deseada y colóquelo en un baño de agua de un centímetro de profundidad a 37 grados centígrados para descongelar. Añadir 10 mililitros de medio suplementados con 10%FBS en un matraz de cultivo de tejido T75. Abra el vial que contiene el stock celular y aspire cuidadosamente la solución.
Luego transfiera las células al matraz T75. Retire un mililitro de medios del matraz, y transfiérelo de nuevo al vial, y luego transfiéralo de nuevo al matraz para maximizar el rendimiento celular del vial. Apriete la tapa del matraz y estremezca suavemente para dispersar uniformemente las células en suspensión por toda la superficie.
Después de esto, etiquete el matraz con la información que se muestra aquí, y colóquelo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. En primer lugar, recupere el matraz de cultivo de tejido de la incubadora y observe las células adheridas como se describe en el protocolo de texto. Aspirar todo el volumen de medios del matraz y transferirlo a un contenedor de residuos.
Agregue cinco mililitros de solución salina equilibrada al matraz y estremece suavemente para enjuagar cualquier exceso de medios, células muertas o producto de desecho. A continuación, retire todo el volumen de solución salina del matraz y deséchela en un recipiente de residuos. A continuación, agregue dos mililitros de trippsina al matraz y mezcle suavemente para dispersar la enzima sobre las células adheridas.
Asegúrese de que la superficie adherente esté completamente saturada y coloque el matraz de tejido en la incubadora durante dos o tres minutos. Después de esto, toque suavemente el lado del matraz de tres a cinco veces para ayudar a facilitar el desprendimiento de celdas. Limpie el matraz con 70% de alcohol y colóquelo en el gabinete de bioseguridad.
Añadir cinco mililitros de medios de stock al matraz de tejido para detener la reacción del sustrato enzimático. Aspirar todo el volumen de líquido del matraz y transferirlo a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 200 g y a 25 grados centígrados durante cinco minutos.
Luego use 70%alcohol para limpiar el tubo que contiene las células peletadas, y colóquelo dentro del gabinete de bioseguridad. Pipeta fuera de los medios, dejando atrás aproximadamente 250 microlitros de líquido con el pellet celular. Ejecute la parte inferior del tubo cónico a través de las ranuras del vial de un bastidor de tubo de microcentrífuga para crear una vibración rápida y perturbar y resuspender el pellet celular.
Cuando se complete correctamente, la nueva solución celular aparecerá como una mezcla turbia sin pellet restante. Agregue dos mililitros de medios a la resuspensión celular. Pipetear las células suavemente hacia arriba y hacia abajo en el lado del tubo 20 veces para romper cualquier grupo.
Y registre el volumen total de la suspensión celular. A continuación, utilice una pipeta estéril para añadir 20 microlitros de material azul tripano a un pozo vacío de una placa de 96 pozos. Con una punta de pipeta estéril, transfiera 20 microlitros de material celular del tubo de 15 mililitros al pozo que contiene la solución azul tripano.
Pipetear suavemente para mezclar el contenido y transferir 10 microlitros de la mezcla entre el resbalón de la cubierta y la cámara de recuento en un hemocitoómetro. Cuente solo las celdas en el centro y cuatro cuadrados de esquina, contando por separado el recuento total de celdas y el recuento de celdas no viables para los cinco cuadrados identificados. Después de calcular el recuento de células viable, marque una línea horizontal en la parte inferior de una placa de 12 pozos para servir como marca de referencia durante la toma de imágenes.
Diluir el stock celular con medios a una densidad de 19.000 células por mililitro. Luego sembra cada pozo de la placa de 12 pozos con un mililitro del stock celular diluido, mezclando el stock celular periódicamente para asegurar una siembra celular uniforme en los 12 pozos. Etiquete cada placa con la información que se muestra aquí.
Y colóquelo en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que las células crezcan al 100% de confluencia. Recuperar una placa de 12 pozos con células de la incubadora. Usando un microscopio con un objetivo 10x, observe las células y determine la confluencia dentro de cada pozo.
A continuación, aspirar y deshacerse de los medios de crecimiento de cada pozo. Montar una pipeta P200 con una punta estéril de 1-200 microlitrotro. En cada pozo, deslice la punta de la pipeta a través de la superficie de la celda desde la ubicación de las 12:00 hasta la ubicación de las 6:00 para producir una herida simulada de arañazos.
Enjuague cada pozo con un mililitro de solución de sal equilibrada para eliminar el exceso de residuos y grumos celulares. Mece la placa de lado a lado para facilitar el lavado. A continuación, retire y deseche la solución de sal equilibrada de cada pozo.
Usando un pipetter P1000 con una punta de 1.000 microlitros, agregue 1.000 microlitros de las existencias de arsénico preparadas en pozos que han sido asignados aleatoriamente con un grupo de tratamiento. Utilice una nueva punta de pipeta para cada pozo y registre el tiempo en que se agregan los tratamientos. Incubar las placas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Para crear imágenes de las placas, capture imágenes de cada pozo con un aumento objetivo de 10 veces cada cuatro horas durante un período de 24 horas. Haga referencia a la línea dibujada anteriormente en la parte inferior de la placa para crear una imagen de la misma ubicación a lo largo del rasguño dentro de cada pozo en cada punto de tiempo. En este estudio, se utiliza un ensayo de prueba de scratch in vivo para observar los efectos del arsénico en la migración celular.
Se observan arañazos uniformes en todos los grupos de tratamiento, con una anchura media de arañazo de aproximadamente 0,8 milímetros. Las células de control muestran un rasguño completamente curado después de 20 horas. Los dos grupos de arsénico no muestran este nivel de curación.
Con el tratamiento de 10 micromolares inhibiendo el cierre por completo durante 24 horas. Estos resultados demuestran que la presencia de arsénico ralentiza la migración celular. Las imágenes sin procesar capturadas durante el ensayo se analizan utilizando software automatizado para medir el ancho de la herida, luego calcular el porcentaje de cierre y, finalmente, calcular el área debajo de la curva.
El grupo de tratamiento de 10 micromolares muestra una migración celular estadísticamente lenta de fibroblastos dérmicos neonatales humanos en comparación con todos los demás grupos de tratamiento. Es importante practicar a fondo esta técnica para aumentar la consistencia al rascar las células. La variabilidad involuntaria entre los ensayos puede potencialmente sesgar los datos y alterar las conclusiones.
Se pueden emplear otras técnicas moleculares, como la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa y los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, para identificar señales y proteínas mensajeras que puedan ser el objetivo de los cambios en la migración celular observados en el ensayo. Este ensayo ha contribuido a la comprensión de los investigadores de la metástasis del cáncer, nuevas terapias emergentes contra el cáncer, células madre y medicina regenerativa, y muchos otros hitos científicos.
