A migração celular é um processo crítico de cicatrização de feridas que pode alterar drasticamente o resultado de uma ferida cicatrizante. Este protocolo permite que os pesquisadores entendam melhor o efeito de vários compostos na migração celular durante a cicatrização de feridas. O que muitas vezes pode levar a estratégias de tratamento direcionadas para a medicina clínica.
O ensaio de arranhões é uma abordagem econômica e de alto rendimento para gerar dados significativos de cicatrização de feridas antes de testes in vivo caros e demorados. O ensaio de arranhões como método é particularmente relevante em aplicações de cicatrização de feridas. Mais especificamente, a pele.
No entanto, o ensaio é realmente um ensaio de migração, e pode ser aplicado a qualquer tipo de célula onde a migração de células é de interesse para medir ou capturar. Semelhante à cultura clássica de células e tecidos, procedimentos operacionais padrão, treinamento, técnica e prática, prática, prática. Essas são a chave para o sucesso com o ensaio de arranhões.
Demonstrando o procedimento estarão Nathan Cruz, um estudante de mestrado, e Oscar Lujan, pesquisador de graduação. Para iniciar este procedimento, prepare o gabinete de biossegurança II usando uma solução aquosa isopropílico de 70% para realizar um lenço de saneamento, começando nas paredes traseira e lateral, e trabalhando até a placa base. Limpe também todos os materiais que serão usados no ensaio antes de colocá-los no armário.
Em seguida, obtenha frascos contendo a linha celular criopreservada desejada, e coloque um em um banho de água de um centímetro de profundidade a 37 graus Celsius para descongelar. Adicione 10 mililitros de médio suplementado com 10% FBS em um frasco de cultura de tecido T75. Abra o frasco contendo o caldo celular e aspire cuidadosamente a solução.
Em seguida, transfira as células para o frasco T75. Remova um mililitro de mídia do frasco, e transfira-o de volta para o frasco, e depois transfira-o de volta para o frasco para maximizar o rendimento da célula do frasco. Aperte a tampa do frasco e balance-a suavemente para dispersar uniformemente as células em suspensão por toda a superfície.
Depois disso, rotule o frasco com as informações aqui mostradas, e coloque-o em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Primeiro, recupere o frasco de cultura tecidual da incubadora e observe as células aderidas conforme descrito no protocolo de texto. Aspire todo o volume de mídia do frasco e transfira-o para um recipiente de lixo.
Adicione cinco mililitros de solução de sal balanceada ao frasco, e balance-o suavemente para enxaguar qualquer excesso de mídia, células mortas ou resíduos. Em seguida, remova todo o volume de solução de sal do frasco e descarte-o em um recipiente de resíduos. Em seguida, adicione dois mililitros de trippsina ao frasco, e balance-o suavemente para dispersar a enzima sobre as células aderidas.
Certifique-se de que a superfície aderente está completamente saturada, e coloque o frasco de tecido na incubadora por dois a três minutos. Depois disso, toque suavemente na lateral do frasco três a cinco vezes para ajudar a facilitar o descolamento celular. Limpe o frasco com 70% de álcool, e coloque-o no armário de biossegurança.
Adicione cinco mililitros de mídia de estoque ao frasco de tecido para parar a reação do substrato da enzima. Aspire todo o volume de fluido do frasco, e transfira-o para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 200 vezes g e a 25 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, use 70% de álcool para limpar o tubo contendo as células pelleted, e colocá-lo dentro do armário de biossegurança. Pipeta fora da mídia, deixando para trás aproximadamente 250 microliters de fluido com a pelota celular. Execute a parte inferior do tubo cônico através das ranhuras de frasco de um rack de tubo de microcentrifuuge para criar uma vibração rápida e perturbar e resuspendar a pelota celular.
Quando concluída corretamente, a nova solução celular aparecerá como uma mistura nublada sem pelotas restantes. Adicione dois mililitros de mídia à ressuspensão celular. Pipeta as células suavemente para cima e para baixo na lateral do tubo 20 vezes para quebrar qualquer aglomerado.
E registo o volume total de suspensão celular. Em seguida, use uma pipeta estéril para adicionar 20 microliters de estoque azul trypan a um poço vazio de uma placa de 96 poços. Usando uma ponta de pipeta estéril, transfira 20 microliters de estoque celular do tubo de 15 mililitros para o poço que contém a solução azul trypan.
Pipeta suavemente para misturar o conteúdo e transferir 10 microliters da mistura entre o deslizamento da tampa e a câmara de contagem em um hemócito. Conte apenas as células no centro e quatro quadrados de canto, contando separadamente tanto a contagem total de células quanto a contagem de células não viáveis para os cinco quadrados identificados. Depois de calcular a contagem de células viável, marque uma linha horizontal na parte inferior de uma placa de 12 poços para servir como marca de referência durante a imagem.
Diluir o estoque celular com mídia para uma densidade de 19.000 células por mililitro. Em seguida, semeou cada poço da placa de 12 poços com um mililitro do estoque celular diluído, misturando o estoque celular periodicamente para garantir até mesmo a semeadura celular em todos os 12 poços. Rotule cada placa com as informações mostradas aqui.
E colocá-lo em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que as células cresçam até 100% de confluência. Recupere uma placa de 12 poços com células da incubadora. Usando um microscópio com um objetivo de 10x, observe as células e determine a confluência dentro de cada poço.
Em seguida, aspirar e eliminar a mídia de crescimento de cada poço. Monte uma pipetter P200 com uma ponta estéril de 1-200 microliteres. Em cada poço, deslize a ponta da pipeta através da superfície celular do local das 12:00 até o local das 6:00 para produzir uma ferida simulada de arranhão.
Enxágüe cada poço com um mililitro de solução de sal balanceada para limpar o excesso de detritos e aglomerados celulares. Balance a placa de um lado para o outro para facilitar a lavagem. Em seguida, remova e descarte a solução de sal balanceada de cada poço.
Usando um pipetter P1000 com uma ponta de 1.000 microliteres, adicione 1.000 microliters dos estoques de arsênico preparados em poços que foram aleatoriamente atribuídos com um grupo de tratamento. Use uma nova ponta de pipeta para cada poço e registe o tempo em que os tratamentos são adicionados. Incubar as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Para imaginar as placas, capture imagens de cada poço em 10x de ampliação objetiva a cada quatro horas durante um período de 24 horas. Consulte a linha anteriormente desenhada na parte inferior da placa para imaginar o mesmo local ao longo do arranhão dentro de cada poço em cada ponto de tempo. Neste estudo, um ensaio de teste de risco in vivo é usado para observar os efeitos do arsênico na migração celular.
Arranhões uniformes são observados em todos os grupos de tratamento, com uma largura média de risco de aproximadamente 0,8 milímetros. As células de controle mostram um arranhão completamente curado após 20 horas. Os dois grupos de arsênico não mostram esse nível de cura.
Com o tratamento de 10 micromolar inibindo o fechamento por 24 horas. Esses resultados demonstram que a presença de arsênico retarda a migração celular. As imagens brutas capturadas durante o ensaio são analisadas usando software automatizado para medir a largura da ferida, depois calcular o fechamento percentual e, finalmente, calcular a área sob a curva.
O grupo de tratamento de 10 micromolares mostra migração celular estatisticamente retardada de fibroblastos deérmicos neonatais humanos em comparação com todos os outros grupos de tratamento. É importante praticar minuciosamente essa técnica para aumentar a consistência ao coçar as células. A variabilidade não intencional entre os ensaios pode potencialmente distorcer dados e alterar conclusões.
Outras técnicas moleculares, como a reação quantitativa da cadeia de polimerase e ensaios imunosorbentes ligados à enzima podem ser empregadas em ensaios pós-risco para identificar sinais mensageiros e proteínas que podem ser o alvo para mudanças na migração celular observadas no ensaio. Este ensaio contribuiu para a compreensão dos pesquisadores sobre metástase do câncer, novas terapias emergentes de câncer, células-tronco e medicina regenerativa, e muitos outros marcos científicos.
