PIVECは、細胞培養物を現実世界のエアロゾルに直接曝露することができるので、このプロトコルは重要である。システムは人が呼吸する同じ空気をサンプルするように警告することができ、新しいタイプの大気質モニタリングを可能にする。この技術の主な利点は、入院源や呼吸ゾーン内など、ベンチトップシステムにアクセスできない場所で培養肺細胞にエアロゾルを捕獲しやすいことです。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室を卒業した最近の卒業生であるリン・セカンド博士と、私の研究室の学部生であるナサニエル・ワイガルです。この実験では、試験材料と制御環境を試験前に24時間保存しました。乾燥分散システムを組み立てるには、ボールバルブを4インチ長い1/8サイズのネジパイプの一端に接続します。
これは、粒子ホッパーとして機能します。粒子ホッパーの開いた端を通して、所望の量の銅ナノ粒子を入れる。次に、パーティクルホッパーを別のボールバルブで閉じます。
2インチの長さ、1/8サイズのパイプをバルブに接続します。2 インチパイプの周りに長さ 3 インチ、1/2 インチの外径チューブを配置します。HEPAフィルターを短いチューブの内側に挿入し、流れ方向がボールバルブを通っていることを確認します。
ねじを使用して、他のボールバルブに真空発生器を接続します。次に、真空発生器を空気タンクに接続します。真空発生器の出口に1/4インチの外径チューブを置き、実験用セットアップに接続します。
空気タンクのメインバルブとレギュレータバルブを回して、目的の流れを設定します。HEPAフィルターに最も近いボールバルブを開き、真空発生器に最も近いボールバルブを開きます。それらを閉じる前に、特性評価や露出中にそれらを開いたままにしてください。
まず、真空発生器に最も近いボールバルブ、次にHEPAフィルタに最も近いボールバルブ。空気タンクのメインバルブとレギュレータバルブを閉じて、流れを止めます。クリーンアップするには、ボールバルブと真空発生器を洗浄するために70%エタノールを使用してください。
滅菌のためにオートクレーブに金属パイプを入れてください。空気液界面で細胞を培養した後、細胞が24時間平衡化することを可能にする。組み立てるには、PIVECベースを上に向けて取り、細胞培養インサートアダプタを上部に接続します。
マイクロピペットを用いてPIVECの基底のウェルに4ミリリットルの細胞培養培地を加える。ピンセットを使用して、アダプター内に細胞培養挿入物を配置します。PIVECトップピースの狭い部分を上に向けた後、アダプタに接続します。
慎重に、ダクトテープの単一の層でPIVECを包みます。PIVECの上部と下部に37ミリメートルのカセット片を接続するために押します。カセットの入口と出口に1/4インチの有刺鉄線アダプターを入れる。
PIVECの周りに抵抗ヒーターを、ベースのワイヤーで包みます。テープを保護します。絶縁のためのアルミホイルの8ラウンドでPIVECを包み、テープで固定します。
PIVECの上部にあるアダプターに1/2インチの外径チューブを接続します。滅菌水から多孔質チューブを取り除き、PIVECの上にチューブ内に配置します。ヒュームフードにシステムを移し、リングスタンドにPIVECを固定し、固定します。
エアロゾル発電機の出口にある直径1/4インチのチューブを多孔管に接続して、PIVECをエアロゾルシステムに接続します。Y コネクタで HEPA フィルタと真空ポンプに接続されている直径 1/4 インチのチューブに PIVEC の出口を接続します。バルブをオンにし、ポンプの流量を毎分0.5リットルに設定します。
バルブを閉じてポンプを遮断する前に、10分間細胞を銅ナノ粒子にさらします。エアロゾルシステムからPIVECを取り外します。ピンセットを使用して細胞培養インサートを取り出し、滅菌ウェルプレートに入れて、所望の生物学的アッセイを開始します。
提案された露光時間ポイントは、インキュベーターに挿入物を戻す。スポイトを使用してPIVECから吸引媒体。70%エタノールを使用してPIVECを洗浄し、次の実験の前に少なくとも30分間紫外線で殺菌してください。
PIVECは、銅ナノ粒子の3つのサイズを使用して、堆積効率を決定することを特徴付けました。24ウェル設計では全体的に増量沈着が観察され、その後6つの井戸設計が観察されます。40ナノメートルと800ナノメートルの銅粒子に比べて100ナノメートルでわずかに減少します。
銅ナノ粒子エアロゾルの粒子数濃度は、フィルタベースの走査移動度粒子サイザ、ならびに光学粒子サイザー測定によって決定した。露光後分析は、37ミリメートルフィルターと細胞培養挿入物との間の用量関係を決定することによって迅速に行うことができる。この比較は、p値が0.05未満の800ナノメートル銅粒子に対する強い相関を示している。
文献全体にわたる体外露光系における垂直流量と比較して、試験された粒子サイズの範囲にわたるPIVECの堆積効率は、報告された値と比較して、または増加する。覚えておくべきことは、このプロトコルは実験室での設定でのPIVECの使用を実証しているが、それは暴露部位でエアロゾルへの細胞応答を測定するように設計されていたということです。オンサイトテストを実施する場合、試験エアロゾルの堆積効率を特徴付ける必要があります。
堆積効率は、細胞が露出する粒子の堆積線量を決定する。追加の生物学的アッセイは、暴露によるより多くの細胞応答エンドポイントを調査するために行うことができる。PIVECは金属バインダーの噴射、および融合フィラメントの製造のような3D印刷プロセスの間に発生するエアロゾルによる細胞応答を査定するために使用されている。
ナノ粒子の使用は、特にエアロゾルの形態では危険であり、あらゆる暴露はヒュームフードで行われるべきである。細胞の仕事は生物安全キャビネットで行われるべきである。
