Este protocolo é significativo, pois o PIVEC permite a exposição direta de uma cultura celular a aerossóis do mundo real. O sistema pode ser avisado para provar o mesmo ar que uma pessoa respira, permitindo um novo tipo de monitoramento da qualidade do ar. A principal vantagem dessa técnica é a facilidade de capturar aerossóis em células pulmonares cultivadas em locais inacessíveis para sistemas de bancada, como na fonte de admissão ou dentro da zona respiratória.
Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Lynn Secondo, recém-formado no meu laboratório, e Nathaniel Wygal, um estudante de graduação do meu laboratório. Para este experimento, armazenados materiais de teste e ambiente controlado por 24 horas antes do teste. Para montar o sistema de dispersão seca, conecte a válvula de esfera a uma extremidade do tubo roscado de quatro polegadas de comprimento e 1/8 de tamanho.
Isso serve como o funil de partículas. Através da extremidade aberta do funil de partículas, coloque a quantidade desejada de nanopartículas de cobre. Em seguida, feche o funil de partículas com outra válvula de esfera.
Conecte o tubo de dois centímetros de comprimento e tamanho 1/8 à válvula. Coloque uma tubulação externa de 3 polegadas de comprimento e 1/2 polegada em torno do tubo de duas polegadas. Insira um filtro HEPA dentro da tubulação curta, garantindo que a direção de fluxo seja através da válvula da esfera.
Usando rosca, conecte o gerador de vácuo à outra válvula de esfera. Em seguida, conecte o gerador de vácuo ao tanque de ar. Coloque tubos de 1/4 polegada de diâmetro externo sobre a saída do gerador de vácuo para conectá-lo à configuração experimental.
Gire a válvula principal e as válvulas reguladoras do tanque de ar para definir o fluxo desejado. Abra a válvula de esfera, mais próxima do filtro HEPA e abra a válvula de esfera mais próxima do gerador de vácuo. Mantenha-os abertos durante a caracterização ou exposição antes de fechá-los.
Primeiro a válvula de esfera mais próxima do gerador de vácuo e, em seguida, a válvula de esfera mais próxima do filtro HEPA. Feche as válvulas principais e reguladoras no tanque de ar para parar o fluxo. Para limpar, use 70% de etanol para lavar válvulas de esfera e gerador de vácuo.
Coloque tubos de metal em autoclave para esterilização. Depois de esculpir células na interface líquida de ar, permita que as células se equilibrem por 24 horas. Para montar, pegue a base PIVEC com o poço voltado para cima e conecte o adaptador de inserção de cultura celular na parte superior.
Adicione quatro mililitros de mídia de cultura celular ao poço da base do PIVEC usando uma micropipette. Use pinças para colocar a inserção da cultura celular dentro do adaptador. Com a parte estreita da peça superior PIVEC voltada para cima, conecte-se ao adaptador.
Cuidadosamente, enrole pivec com uma única camada de fita adesiva. Empurre para conectar peças de de 37 milímetros na parte superior e inferior do PIVEC. Coloque adaptadores farpados de 1/4 polegada em entrada e saída de.
Enrole o aquecedor resistivo ao redor de PIVEC com os fios na base. Fita para segurança. Enrole o PIVEC com oito rodadas de papel alumínio para isolamento e fixe com fita.
Conecte tubos de 1/2 polegada de diâmetro externo ao adaptador na parte superior do PIVEC. Remova a tubulação porosa da água estéril e coloque dentro da tubulação em cima do PIVEC. Transfira o sistema para o capô de fumaça e aperte o PIVEC no suporte do anel e proteja.
Conecte o PIVEC ao sistema aerossol conectando a tubulação de 1/4 polegada de diâmetro na saída do gerador de aerossol à tubulação porosa. Conecte a saída do PIVEC a tubos de 1/4 polegada de diâmetro conectados a um filtro HEPA e a uma bomba de vácuo por um conector Y. Ligue as válvulas e ajuste a vazão da bomba para 0,5 litros por minuto.
Exponha as células a nanopartículas de cobre por dez minutos antes de fechar as válvulas e desligar a bomba. Remova o PIVEC do sistema aerossol. Tire a inserção da cultura celular usando pinças e coloque-a na placa de poço estéril para iniciar os ensaios biológicos desejados.
Pontos de tempo de exposição propostos, coloque a inserção de volta na incubadora de dióxido de carbono. Aspirar mídia do PIVEC usando um dropper. Use 70% de etanol para lavar PIVEC e esterilizá-lo com luz ultravioleta por pelo menos 30 minutos antes do próximo experimento.
O PIVEC foi caracterizado usando três tamanhos de nanopartículas de cobre para determinar a eficiência da deposição. O aumento da deposição é observado no geral para o projeto do poço 24, em seguida, o projeto do poço seis. Diminui ligeiramente por 100 nanômetros em comparação com 40 nanômetros e 800 nanômetros de partículas de cobre.
A concentração do número de partículas de aerossóis de nanopartículas de cobre foi determinada pelo dimensionador de partículas baseado em filtro, bem como por medições ópticas de tamanho de partículas. A análise pós-exposição pode ser acelerada determinando a relação de dose entre o filtro de 37 milímetros e a inserção da cultura celular. A comparação mostra uma forte correlação para partículas de cobre de 800 nanômetros com um valor p inferior a 0,05.
Em comparação com os sistemas de exposição in vitro de fluxo perpendicular ao longo da literatura, a eficiência de deposição do PIVEC sobre a faixa dos tamanhos de partículas testadas é comparável ou aumentada do que os valores relatados. O mais importante a ser lembrado é que, embora este protocolo demonstre o uso do PIVEC em um ambiente de laboratório, ele foi projetado para medir respostas celulares a aerossóis no local da exposição. Ao realizar testes no local, é importante caracterizar a eficiência da deposição do aerossol de teste.
A eficiência do depoimento determina a dose depositada de partículas às quais as células estão expostas. Ensaios biológicos adicionais podem ser realizados para investigar mais pontos finais de resposta celular devido à exposição. O PIVEC tem sido usado para avaliar a resposta celular devido a aerossóis gerados durante processos de impressão 3D, como cais de aglutinante metálico e fabricação de filamento fundido.
O uso de nanopartículas, particularmente na forma aerossol, pode ser perigoso e quaisquer exposições devem ser realizadas em um capô de fumaça. O trabalho celular deve ser feito em um armário de biosegurança.
