Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da der PIVEC eine direkte Exposition einer Zellkultur gegenüber realen Aerosolen ermöglicht. Das System kann davor warnen, dieselbe Luft zu beproben, die eine Person atmet, was eine neue Art der Überwachung der Luftqualität ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die einfache Erfassung von Aerosolen an kultivierten Lungenzellen an Orten, die für Tischsysteme nicht zugänglich sind, z. B. an der Zulassungsquelle oder innerhalb der Atemzone.
Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Lynn Secondo, einem Absolventen meines Labors, und Nathaniel Wygal, einem Studenten aus meinem Labor. Für dieses Experiment gespeicherte Prüfmaterialien und kontrollierte Umgebung für 24 Stunden vor dem Test. Um das trockene Dispersionssystem zu montieren, schließen Sie das Kugelhahn an ein Ende des vier Zoll langen, 1/8 großen Gewinderohres an.
Dieser dient als Partikeltrichter. Durch das offene Ende des Partikeltrichters in die gewünschte Menge an Kupfer-Nanopartikeln geben. Schließen Sie dann den Partikelbehälter mit einem weiteren Kugelhahn.
Schließen Sie das zwei Zoll lange, 1/8 große Rohr an das Ventil an. Legen Sie einen drei Zoll langen, 1/2 Zoll Außendurchmesser Rohre um das Zwei-Zoll-Rohr. Setzen Sie einen HEPA-Filter in den kurzen Schlauch ein, um sicherzustellen, dass die Strömungsrichtung durch das Kugelventil erfolgt.
Schließen Sie den Vakuumgenerator mit Dem Gewinde an das andere Kugelhahn an. Schließen Sie dann den Vakuumgenerator an den Lufttank an. Legen Sie einen Außendurchmesser über den Auslass des Vakuumgenerators, um ihn an den Versuchsaufbau anzuschließen.
Drehen Sie das Hauptventil und die Reglerventile am Lufttank, um den gewünschten Durchfluss einzustellen. Öffnen Sie das Kugelhahn, am nächsten an HEPA-Filter dann öffnen Sie das Kugelhahn am nächsten zum Vakuumgenerator. Halten Sie sie während der Charakterisierung oder Belichtung offen, bevor Sie sie schließen.
Zuerst das Kugelhahn am nächsten an Vakuumgenerator, und dann das Kugelhahn am nächsten HEPA-Filter. Schließen Sie Haupt- und Reglerventile am Lufttank, um den Durchfluss zu stoppen. Zum Aufräumen verwenden Sie 70% Ethanol, um Kugelhähne und Vakuumgenerator zu waschen.
Legen Sie Metallrohre in Autoklaven für die Sterilisation. Nach der Kultivierung von Zellen an der Luftflüssigkeitsschnittstelle, lassen Sie Zellen für 24 Stunden ausausgleichen. Um zu montieren, nehmen Sie die PIVEC-Basis mit dem Gut nach oben und verbinden Sie die Zellkultur-Einsatzadapter auf der Oberseite.
Fügen Sie mit einer Mikropipette vier Milliliter Zellkulturmedien in den Brunnen der Basis des PIVEC ein. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Zellkultureinsatz innerhalb des Adapters zu platzieren. Mit dem schmalen Teil des PIVEC-Oberteils nach oben, schließen Sie sich an den Adapter an.
Wickeln Sie PIVEC sorgfältig mit einer einzigen Schicht Klebeband. Drücken Sie, um 37-Millimeter-Kassettenteile auf oberund unten von PIVEC zu verbinden. Legen Sie 1/4 Zoll Stacheladapter in Kassetteneinlass und Auslass.
Wrap Resistive Heizung um PIVEC mit den Drähten an der Basis. Band zum Sichern. Wrap PIVEC mit acht Runden Aluminiumfolie für die Isolierung, und sichern Sie mit Klebeband.
Schließen Sie einen Außendurchmesser mit einem Außendurchmesser an den Adapter auf der Oberseite des PIVEC an. Poröse Schläuche aus sterilem Wasser entfernen und in Schläuche auf PIVEC legen. Transfersystem zur Rauchhaube und Klemmen des PIVEC am Ringständer und sicher.
Schließen Sie PIVEC an das Aerosolsystem an, indem Sie die Rohre mit einem Durchmesser von 1,4 Zoll am Ausgang des Aerosolgenerators mit den porösen Schläuchen verbinden. Schließen Sie den Ausgang des PIVEC an Rohre mit einem Durchmesser von 1/4 Zoll an, die über einen Y-Anschluss mit einem HEPA-Filter und einer Vakuumpumpe verbunden sind. Schalten Sie die Ventile ein und stellen Sie den Pumpendurchfluss auf 0,5 Liter pro Minute ein.
Setzen Sie die Zellen zehn Minuten lang Kupfer-Nanopartikeln aus, bevor Sie die Ventile schließen und die Pumpe abschalten. Entfernen Sie PIVEC aus dem Aerosolsystem. Nehmen Sie den Zellkultureinsatz mit einer Pinzette heraus und legen Sie ihn in die sterile Brunnenplatte, um gewünschte biologische Tests zu beginnen.
Vorgeschlagene Expositionszeitpunkte, setzen Sie den Einsatz zurück in den Kohlendioxid-Inkubator. Aspirieren Sie Medien von PIVEC mit einem Traber. Verwenden Sie 70% Ethanol, um PIVEC zu waschen und es mit ultraviolettem Licht für mindestens 30 Minuten vor dem nächsten Experiment zu sterilisieren.
Der PIVEC wurde mit drei Größen von Kupfer-Nanopartikeln charakterisiert, um die Abscheidungseffizienz zu bestimmen. Erhöhte Ablagerung wird insgesamt für die 24 Brunnen-Design beobachtet, dann die sechs Brunnen-Design. Im Vergleich zu 40 Nanometer und 800 Nanometer Kupferpartikeln nimmt er für 100 Nanometer leicht ab.
Die Partikelkonzentration von Kupfer-Nanopartikel-Aerosolen wurde durch filterbasierte Scan-Mobilitätspartikel-Sizer sowie optische Partikel-Sizer-Messungen bestimmt. Die Analyse nach der Exposition kann beschleunigt werden, indem die Dosisbeziehung zwischen dem 37-Millimeter-Filter und dem Zellkultureinsatz bestimmt wird. Der Vergleich zeigt eine starke Korrelation für 800 Nanometer Kupferpartikel mit einem p-Wert von weniger als 0,05.
Im Vergleich zu in-vitro-Expositionssystemen mit senkrechtem Fluss in der gesamten Literatur ist die Abscheidungseffizienz des PIVEC über den Bereich der getesteten Partikelgrößen mit den gemeldeten Werten vergleichbar oder erhöht. Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, dass dieses Protokoll zwar die Verwendung des PIVEC in einer Laborumgebung demonstriert, aber entwickelt wurde, um die zellulären Reaktionen auf Aerosole am Expositionsort zu messen. Bei der Durchführung von Vor-Ort-Tests ist es wichtig, die Abscheidungseffizienz des Testaerosols zu charakterisieren.
Die Abscheidungseffizienz bestimmt die abgeschiedene Dosis von Partikeln, denen die Zellen ausgesetzt sind. Zusätzliche biologische Assays können durchgeführt werden, um mehr zelluläre Reaktionsendpunkte aufgrund der Exposition zu untersuchen. Der PIVEC wurde verwendet, um die zelluläre Reaktion aufgrund von Aerosolen zu bewerten, die während 3D-Druckprozessen erzeugt werden, wie z. B. Metallbinder-Jetting und Schmelzfilamentherstellung.
Die Verwendung von Nanopartikeln, insbesondere in Aerosolform, kann gefährlich sein, und jegliche Exposition sollte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden. Die zelluläre Arbeit sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden.
