פרוטוקול זה מאפשר לנו לבודד ולתרבת דו-BBT גבוה, הידוע רק לקרדיומיוציטים של עכברים. כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה, ניתן לנתח את קצב צריכת החמצן של קרדיומיוציטים על ידי מנתח שטף כסף בפועל. אחד היתרונות של טכניקה זו היא כי צריכת חמצן של cardiomyocytes ניתן למדוד בקלות במצבם חסידי בפורמט 96-well, אשר מאפשר בדיקות של תנאים מרובים עם מספר רב של שכפולים.
כלי זה מספק תובנות חשובות על תחום המחקר של קרדיולוגיה. בנוסף לצריכת חמצן, אנו יכולים גם ללמוד פרמטרים מטבוליים אחרים, כגון greygrices ו אפוקסידציה peracid. השגת שונות גבוהה של קרדיומיוציטים היא קריטית לניסוי זה.
זה דורש עיכול יעיל של לבבות. מאז קרדיומיוציטים ניאו-נטאל הם שבירים מאוד, טיפול עדין של קרדיומיוציטים חשוב גם. במכסה המנוע של תרבות התא, aliquot 5 מ"ל של HBSS לכל באר של צלחת תרבות תא 6 באר ולה מניחים אותו על קרח.
בנוסף, aliquot 10 מ"ל של HBSS לצלחת תרבות תאים 10 ס"מ, ולאחר מכן, להכין 20 מ"ל של פתרון Predigestion טריפסין בצינור חרוט סטרילי 50 מ"ל. שמור את כל הפתרונות על קרח. לאחר מכן, לחלץ את הלב ולהעביר אותו מיד לצלחת תרבות התא סטרילי המכיל HBSS.
הסר כל רקמת ריאה שיורית וכלי גדולים יותר. לשטוף את הלב HBSS באמצעות תסיסה עדינה. לאחר מכן, חותכים את הלב עם מספריים עדין לתוך 8 חתיכות ולהעביר את רקמת הלב עם מדפים לתוך באר אחת של צלחת תרבות תא 6-well עם HBSS.
באמצעות כף מוריה, לשטוף את רקמת הלב על ידי העברת אותו גם גם בצלחת 6-well מלא HBSS. ואז להעביר את רקמת הלב לתוך צינור חרוט המכיל 20 מ"ל של טריפסין דגירה עם תסיסה עדינה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. בהליך זה, לפני המלחמה את פתרון עיכול הקולגנס באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
מעבירים את הצינור החטטני המכיל רקמת לב ותסמת עיכול מ-4 מעלות צלזיוס למכסה המנוע של תרבות התאים. תן לרקמת הלב לשקוע לתחתית הצינור ולהסיר את פתרון predigestion באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של HBSS לתוך הצינור.
תן שוב את רקמת הלב עם HBSS 2 עד 3 פעמים כדי לשטוף את טריפסין באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. שאפו HBSS והוסיפו 10 מ"ל של פתרון עיכול קולגנס לפני המלחמה לתוך הצינור עם רקמת לב. לעיכול הראשון, דגירה הצינור עם רקמת לב באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ללא תסיסה.
לאחר מכן, להעביר את הצינור למכסה המנוע של תרבות התא. טריטוראט הרקמה על ידי resuspending אותו בעדינות 10 פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. זה יאפשר ללב להתפזר ואת התאים להשתחרר מרקמה הלב.
תן לרקמה הלא מעוכלת לשקוע. מעבירים את הפתרון המתעכל המועשר בקרדיומיוציטים לצינור חרוט חדש ומיד מוסיפים כמות שווה של מדיום תרבות תאים כדי לעצור את עיכול הקולגנס. לאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של פתרון עיכול קולגן לתוך הצינור המכיל את רקמת הלב מעוכל הנותרים.
לעיכול השני, דגירה הצינור עם רקמת לב באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חזור על ההליכים של העיכול הראשון ולהעביר את הפתרון מתעכל מועשר cardiomyocytes לצינור חרוט חדש לפני עצירת עיכול קולגן. לאחר מכן, מניחים מסננת תאים סטריליים בצינור חרוט סטרילי חדש של 50 מ"ל.
הרטב מראש את מסננת התאים עם 2 עד 3 מ"ל של מדיום תרבות התא ולהעביר את התאים דרך מסננת התא. לאחר מכן, לשטוף את מסננת התא עם מדיום תרבות התא. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור חרוט המכיל קרדיומיוציטים במשך 5 דקות ב 180 פעמים כוח הכבידה.
לאחר 5 דקות, שאף את supernatant ו resuspend גלולת התא ב 10 מ"ל של מדיום תאים. צלחת התאים על צלחת תברית תאים 10 ס"מ להחגירה אותם במשך שעה אחת. לאחר מכן, להתסיס בעדינות את הצלחת.
לשטוף את התאים שאינם חסידים resuspend התאים על ידי צינורות שוב ושוב את מדיום תרבות התא מעל המנה באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. לאחר מכן, להעביר את התאים שאינם חסידים לתוך צלחת חדשה 10 ס"מ תאים תרבות הדגירה אותם במשך שעה נוספת. לאחר שעה, להתסיס בעדינות את הצלחת ולשטוף את התאים שאינם חסידים.
מעבירים את הקרדיומיוציטים לצינור חרוט חדש של 50 מ"ל. לאחר מכן, הכינו צלחת תרבות של 96 בארות על ידי ציטוט 50 מיקרוליטרים של פתרון ציפוי בכל באר של צלחת תרבות התאים בת 96 הבאר. אם קיימות בועות, הסר אותן באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר.
הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת כדי לאפשר ייבוש של ציפוי מטריצה. לאחר מכן, לספור את התאים באמצעות hemocytometer. צלחת התאים לתוך מטריצה תיסים מצופה 96 באר צלחת תאים בצפיפות בין 10 ל 30 אלף תאים ל הבאר.
ושים את התאים באינקובטר. כדי ליצור מראש את בדיקת צריכת החמצן, לחות מחסנית חיישן מנתח שטף לפחות 3 שעות, להוסיף 200 microliters של פתרון כיול לתוך כל באר של צלחת השירות. מניחים את מחסנית החיישן בחזרה על צלחת השירות ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ללא CO2 או O2 תוספי לפחות 3 שעות.
שעה אחת לפני הבדיקה, להסיר בעדינות את מדיום תרבות התא ולשטוף את התאים עם 200 microliters של מבחן מתח מיטוכונדריאלי טרום המלחמה מדיום פעמיים. לאחר הכביסה השנייה, הוסיפו 175 מיקרוליטרים של מדיום בדיקת מתח מיטוכונדריאלי לפני המלחמה. ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני או תוספי חמצן.
הכינו 3 מ"ל של כל אחת מתרכובות הבדיקה במדיום בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי. טען 25 מיקרוליטרים של כל תרכובת לתוך יציאות המזרק של מחסנית החיישן באמצעות פיפטה רב ערוצית. מצב התאים וכל טיפול מקדים יכול להשפיע על שיקום מרבי עורר על ידי הזרקה של FCCP uncoupler.
רגישות התא uncoupler יכול גם להשתנות, ולכן, זה קריטי כדי לייעל את ריכוז העבודה של FCCP עבור כל טיפול מסוים. לאחר מכן, הגדר פרוטוקול מים של שטף חוץ-תאי והתחל את התוכנית. ראשית, שים את קרטיג' החיישן במכונה לכיול.
החלף את הכיול עבור לוחית ההתנסויות לאחר שצעד הכיול נעשה. אם תרצה, לאחר ההתמדה, יש להשליך בזהירות את כל המדיום באמצעות פיפטה רב-ערוצית. ולאחסן את mircoplate תרבות התא ב שלילי 20 מעלות צלזיוס לנורמליזציה התא בעתיד באמצעות מראי חלבון.
על ידי שימוש בפרוטוקול המתואר, לבבות בודדו מהיום 0 גורים ניאו-לידתיים וקרדיומיוציטים נזרעו בציפויות של 10, 20 או 30 אלף תאים ל באר בצלחות 96 בארות. לאחר תרבות הלילה, קרדיומיוציטים נמצאו מחוברים היטב למשטח הפלסטיק הצפוי, היו מעט מאוד תאים לא מחוברים. בשלב זה, באופן ספונטני נדבק קרדיומיוציטים נראו בקלות.
צפיפות זריעה של 30,000 תאים לגם הראתה קונפלונס יום אחד לאחר הזריעה כשהתאים מתפשטים. קרדיומיוציטים היו immunostained עם נוגדן נגד אקטין אלפא סרקומרי, סמן ספציפי cardiomyocyte. כפי שמוצג כאן, רוב התאים הראו כתמים חיוביים של אלפא actinin המציין את הטוהר הגבוה של בידוד cardiomyocyte.
תוכנית של מבחן מתח מיטוכונדריאלי טיפוסי אחד מוצגת כאן. מבחן הלחץ המיטוכונדריאלי מתחיל במדידת קו בסיס של שיעור צריכת החמצן, ואחריו הזריקה של מיוסין אוליגו אשר מעכב ATPA של. לאחר מכן, הסוכן הלא מפריד FCCP הוזרק כדי למדוד את שיעור צריכת החמצן המרבי.
לבסוף, עם הזרקה של שני מעכבי תחבורה אלקטרונים מורכבים, הנשימה המיטוכונדרית מפסיקה לחלוטין OCR יורד לרמתו הנמוכה ביותר. כדי להשיג תוצאות עקביות ותשוחזרות. זה קריטי כדי להשיג שרידות גבוהה.
לכן, חשוב להשתמש ביילודים שזה עתה נולדו וטופלו בעדינות ברקמות הלב בקרדיומיוציטים. באמצעות קווי עכבר חדשים או קיימים מניפולציה גנטית, שיטה זו יכולה להיות מתורגמת בקלות לנתונים שעלולים להוביל להבנת מנגנונים חדשים לוויסות ביו-אנרגטי בלב. מיטוכונדריה לשחק תפקידי מפתח בתפקוד הלב.
אנו מצפים כי שיטה זו תסייע בזיהוי רגולטורים ומסלולים חדשניים המסדירים את חילוף החומרים המחמצן ומציאת יעדים טיפוליים חדשים לטיפול באי ספיקת לב.
