Este protocolo nos permite aislar y cultivar alto bi-BBT, conocido sólo por los cardiomiocitos de ratón. Para evaluar la función mitocondrial, la tasa de consumo de oxígeno de los cardiomiocitos puede ser analizada por un analizador de flujo de plata real. Una de las ventajas de esta técnica es que el consumo de oxígeno de los cardiomiocitos se puede medir fácilmente en su estado adherente en formato de 96 pozos, lo que permite realizar pruebas de múltiples condiciones con un gran número de réplicas.
Este buque proporciona información importante sobre el área de investigación de cardiología. Además del consumo de oxígeno, también podemos estudiar otros parámetros metabólicos, como las greygrices y la epoxidación perácea. Lograr una alta variabilidad de los cardiomiocitos es fundamental para este experimento.
Esto requiere una digestión eficiente de los corazones. Dado que los cardiomiocitos neonatales son muy frágiles, también es importante un manejo suave de los cardiomiocitos. En la capucha de cultivo celular, aliquot 5ml de HBSS a cada pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos y colóquelo en hielo.
Además, alícuota 10ml de HBSS a un plato de cultivo celular de 10 cm, luego, preparar 20 ml de solución de predigestión de trippsina en un tubo cónico estéril de 50 ml. Mantenga todas las soluciones en hielo. A continuación, extraiga el corazón y transfiéralo inmediatamente al plato de cultivo celular estéril que contiene HBSS.
Retire cualquier tejido pulmonar residual y vasos más grandes. Lave el corazón con HBSS con agitación suave. Posteriormente, cortar el corazón con tijeras finas en 8 piezas y transferir el tejido cardíaco con fórceps en un pozo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos con HBSS.
Usando una cuchara de moria, lave el tejido cardíaco transfiriéndolo de pozo a pozo en el plato de 6 pozos lleno de HBSS. Luego transfiera el tejido cardíaco a un tubo cónico que contenga 20 ml de Tripppsin e incubar con agitación suave a 4 grados centígrados durante 4 horas. En este procedimiento, precalienta la solución de digestión de colagenasa en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Transfiera el tubo cónico que contiene tejido cardíaco y la solución de predigestión de 4 grados centígrados a una capucha de cultivo celular. Deje que el tejido cardíaco se hunda hasta la parte inferior del tubo y retire la solución de predigestión utilizando una pipeta serológica de 10 ml. A continuación, agregue 10 ml de HBSS en el tubo.
Resuspender el tejido cardíaco con HBSS 2 a 3 veces para lavar Trypsin con una pipeta serológica de 10 ml. Aspirar HBSS y añadir 10 ml de solución de digestión de colágeno precalentado en el tubo con tejido cardíaco. Para la primera digestión, incubar el tubo con tejido cardíaco en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 minutos sin agitación.
Después, transfiera el tubo a la campana de cultivo celular. Triturar el tejido resuspendiéndolo suavemente 10 veces usando una pipeta serológica de 10 ml. Esto permitirá que el corazón se disperse y que las células se liberen del tejido cardíaco.
Deja que el tejido no digerido se hunda. Transfiera la solución digerida enriquecida en cardiomiocitos a un nuevo tubo cónico e inmediatamente agregue una cantidad igual de medio de cultivo celular para detener la digestión de la colagenasa. A continuación, agregue 10 ml de solución de digestión de colagenasa en el tubo que contiene el tejido cardíaco no digerido restante.
Para la segunda digestión, incubar el tubo con tejido cardíaco en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 10 minutos. Repita los procedimientos de la primera digestión y transfiera la solución digerida enriquecida en cardiomiocitos a un nuevo tubo cónico antes de detener la digestión de la colagenasa. A continuación, coloque un colador celular estéril en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml.
Pre-humedecer el colador celular con 2 a 3 ml de medio de cultivo celular y pasar las células a través del colador celular. Posteriormente, enjuague el colador celular con un medio de cultivo celular. Luego, centrifuga el tubo cónico que contiene cardiomiocitos durante 5 minutos a 180 veces la gravedad.
Después de 5 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 10 ml de medio de cultivo celular. Ina las células en un plato de cultivo celular de 10 cm e incubarlas durante una hora. Después, agita suavemente el plato.
Lavar las células no adherentes y resuspender las células pipeteando repetidamente el medio de cultivo celular sobre el plato usando una pipeta serológica de 10 ml. Luego, transfiera las células no adherentes a un nuevo plato de cultivo celular de 10 cm e incubarlas durante otra hora. Después de una hora, agitar suavemente el plato y lavar las células no adherentes.
Transfiera los cardiomiocitos a un nuevo tubo cónico de 50 ml. A continuación, prepare una placa de cultivo de 96 pozos alí citando 50 microlitros de solución de recubrimiento en cada pozo de la placa de cultivo celular de 96 pozos. Si hay burbujas, retírelas con una pipeta de 20 microlitros.
Incubar la placa a 37 grados centígrados durante al menos una hora para permitir el secado del recubrimiento de la matriz. Luego, cuente las células usando un hemocicómetro. Placar las células en la matriz extra-celular recubierto placa de cultivo celular de 96 pozos a una densidad entre 10 a 30 mil células por pozo.
Y coloca las células en la incubadora. Para preformar el ensayo de consumo de oxígeno, hidrate un cartucho de sensor de analizador de flujo durante al menos 3 horas, agregue 200 microlitros de solución calibradora en cada pozo de la placa de servicio. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de identificación e i incubar en 37 grados centígrados sin suplementos de CO2 u O2 durante al menos 3 horas.
Una hora antes del ensayo, retire suavemente el medio de cultivo celular y lave las células con 200 microlitros de medio de prueba de esfuerzo mitocondrial precalentado dos veces. Después del segundo lavado, agregue 175 microlitros de medio de prueba de esfuerzo mitocondrial precalentado. Luego cultiva las células a 37 grados centígrados sin suplementos de dióxido de carbono ni oxígeno.
Preparar 3ml de cada uno de los compuestos de prueba en medio de prueba de esfuerzo mitocondrial. Cargue 25 microlitros de cada compuesto en los puertos del inyector del cartucho del sensor utilizando una pipeta multicanal. El estado de las células y los pretratamientos pueden afectar a la restauración máxima provocada por la inyección del desacoplador FCCP.
La sensibilidad celular al desacoplador también puede cambiar, por lo tanto, es fundamental optimizar la concentración de trabajo de FCCP para cada tratamiento en particular. Posteriormente, configure el protocolo de ensayo de flujo extracelular e inicie el programa. En primer lugar, coloque la cartiridge del sensor en la máquina para su calibración.
Sustituya el calibrador de la placa de ensayo una vez que se haya realizado el paso de calibración. Si lo desea, después del ensayo, deseche cuidadosamente todo el medio de ensayo utilizando una pipeta multicanal. Y almacene el mircoplate de cultivo celular a 20 grados celsius negativos para la normalización celular futura usando el ensayo de proteínas.
Mediante el uso del protocolo descrito, los corazones fueron aislados del día 0 cachorros neonatales y cardiomiocitos fueron sembrados a densidades de 10, 20 o 30 mil células por pozo en placas de 96 pozos. Después del cultivo nocturno, los cardiomiocitos se encontraron bien unidos a la superficie de plástico recubierta y había muy pocas células no conectadas. En este punto, la contraer espontáneamente cardiomiocitos era fácilmente visible.
Una densidad de siembra de 30.000 células por pozo mostró confluencia un día después de la siembra a medida que las células se propagan. Los cardiomiocitos fueron inmunosutenidos con un anticuerpo contra la actinina alfa sarcomérica, un marcador específico de cardiomiocitos. Como se muestra aquí, la mayoría de las células mostraron tinción positiva de actinina alfa que indica la alta pureza del aislamiento de cardiomiocitos.
Aquí se muestra un esquema de una prueba de esfuerzo mitocondrial típica. La prueba de esfuerzo mitocondrial comienza con una medición de la línea base de la tasa de consumo de oxígeno, esto es seguido por la inyección de miosina oligo que inhibe ATPA. Entonces, el agente de desacoplamiento FCCP fue inyectado para medir la tasa máxima de consumo de oxígeno.
Finalmente, con la inyección de dos inhibidores complejos de transporte de electrones, la respiración mitocondrial se detiene por completo y el OCR disminuye a su nivel más bajo. Para obtener resultados consistentes y reproducibles. Es fundamental lograr una alta supervivencia.
Por lo tanto, es importante utilizar neonatos recién nacidos y manejar suavemente los tejidos cardíacos en cardiomiocitos. Mediante el uso de líneas de ratón nuevas o existentes manipuladas genéticamente, este método se puede traducir fácilmente a datos que pueden conducir a la comprensión de nuevos mecanismos para la regulación bioenergética en el corazón. Los mitocondriales desempeñan un papel clave en la función cardíaca.
Esperamos que este método ayude a identificar nuevos reguladores y vías que regulan el metabolismo oxidante y encontrar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca.
