Questo protocollo ci consente di isolare e culturare il bi-BBT alto, noto solo ai cardiomiociti del topo. Per valutare la funzione mitocondriale, il tasso di consumo di ossigeno dei cardiomiociti può essere analizzato da un analizzatore di flusso d'argento effettivo. Uno dei vantaggi di questa tecnica è che il consumo di ossigeno dei cardiomiociti può essere facilmente misurato nel loro stato aderente in formato 96-well, che consente il test di più condizioni con un gran numero di repliche.
Questa nave fornisce importanti approfondimenti sull'area di ricerca della cardiologia. Oltre al consumo di ossigeno, possiamo anche studiare altri parametri metabolici, come igrici grigi e l'epossidazione peracidica. Raggiungere un'elevata variabilità dei cardiomiociti è fondamentale per questo esperimento.
Ciò richiede un'efficiente digestione dei cuori. Poiché i cardiomiociti neo-natali sono molto fragili, è importante anche una manipolazione delicata dei cardiomiociti. Nella cappa di coltura cellulare, aliquota 5ml di HBSS ad ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 potte e posizionarla sul ghiaccio.
Inoltre, aliquote 10ml di HBSS a un piatto di coltura cellulare da 10 cm, quindi preparare 20 ml di soluzione di predigestione di tripina in un tubo conico sterile da 50 ml. Tieni tutte le soluzioni sul ghiaccio. Quindi, estrarre il cuore e trasferirlo immediatamente nel piatto sterile di coltura cellulare contenente HBSS.
Rimuovere qualsiasi tessuto polmonare residuo e vasi più grandi. Lavare il cuore in HBSS usando un'agitazione delicata. Successivamente, tagliare il cuore con forbici fini in 8 pezzi e trasferire il tessuto cardiaco con le forcep in un unico pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con HBSS.
Usando un cucchiaio moria, lavare il tessuto cardiaco trasfererlo da pozzo a bene nella piastra a 6 po 'piena di HBSS. Quindi trasferire il tessuto cardiaco in un tubo conico contenente 20 ml di tripside e incubare con agitazione delicata a 4 gradi Celsius per 4 ore. In questa procedura, prebelli la soluzione di digestione della collagenasi in un bagno d'acqua a 37 gradi celsius.
Trasferire il tubo conico contenente tessuto cardiaco e soluzione di predigestione da 4 gradi celsius a una cappa di coltura cellulare. Lasciare che il tessuto cardiaco affondi sul fondo del tubo e rimuovere la soluzione di predigestione utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Quindi, aggiungere 10 ml di HBSS nel tubo.
Resuspend il tessuto cardiaco con HBSS da 2 a 3 volte per lavare la tripina usando una pipetta sierologica da 10 ml. Aspirare l'HBSS e aggiungere 10 ml di soluzione di digestione della collagenasi prebellica nel tubo con tessuto cardiaco. Per la prima digestione, incubare il tubo con tessuto cardiaco in un bagno d'acqua a 37 gradi celsius per 10 minuti senza agitazione.
Successivamente, trasferire il tubo nella cappa di coltura cellulare. Triturare il tessuto rimospenselo delicatamente 10 volte usando una pipetta sierologica da 10 ml. Ciò consentirà al cuore di disperdersi e alle cellule di essere rilasciate dal tessuto cardiaco.
Lascia affondare il tessuto non digerito. Trasferire la soluzione digerita arricchita in cardiomiociti in un nuovo tubo conico e aggiungere immediatamente una quantità uguale di mezzo di coltura cellulare per fermare la digestione della collagenasi. Quindi aggiungere 10 ml di soluzione di digestione della collagenasi nel tubo contenente il tessuto cardiaco non digerito rimanente.
Per la seconda digestione, incubare il tubo con tessuto cardiaco in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 10 minuti. Ripetere le procedure della prima digestione e trasferire la soluzione digerita arricchita in cardiomiociti in un nuovo tubo conico prima di interrompere la digestione della collagenasi. Quindi, posizionare un colino cellulare sterile in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml.
Pre-bagnare il filtro cellulare con da 2 a 3 ml di terreno di coltura cellulare e passare le cellule attraverso il filtro cellulare. Successivamente, sciacquare il filtro cellulare con il mezzo di coltura cellulare. Quindi, centrifugare il tubo conico contenente cardiomiociti per 5 minuti a 180 volte la gravità.
Dopo 5 minuti, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 10 ml di mezzo di coltura cellulare. Placcare le cellule su un piatto di coltura cellulare di 10 cm e incubarle per un'ora. Successivamente, agitare delicatamente il piatto.
Lavare le cellule non aderenti e risosopendare le cellule pipettando ripetutamente il mezzo di coltura cellulare sul piatto utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Quindi, trasferire le cellule non aderenti in un nuovo piatto di coltura cellulare da 10 cm e incubarle per un'altra ora. Dopo un'ora, agitare delicatamente il piatto e lavare via le cellule non aderenti.
Trasferire i cardiomiociti in un nuovo tubo conico da 50 ml. Successivamente, preparare una piastra di coltura di 96 porvili aliquotando 50 microlitri di soluzione di rivestimento in ogni pozzo della piastra di coltura cellulare da 96 porvili. Se sono presenti bolle, rimuoverle utilizzando una pipetta da 20 microliter.
Incubare la piastra a 37 gradi celsius per almeno un'ora per consentire l'essiccazione del rivestimento della matrice. Quindi, conta le cellule usando un emocitometro. Placcare le cellule nella piastra di coltura cellulare extracellulare rivestita di 96 po 'ad una densità compresa tra 10 e 30 mila cellule per pozzo.
E mettere le cellule nell'incubatore. Per preformare il saggio sul consumo di ossigeno, idratare una cartuccia del sensore dell'analizzatore di flusso per almeno 3 ore, aggiungere 200 microlitri di soluzione di calibante in ogni pozzo della piastra di utilità. Riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità e incubare in 37 gradi celsius senza integrazione di CO2 o O2 per almeno 3 ore.
Un'ora prima del test, rimuovere delicatamente il mezzo di coltura cellulare e lavare le cellule con 200 microlitri di mezzo di prova di stress mitocondriale prebellico due volte. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 175 microlitri di mezzo di prova di stress mitocondriale prebellico. Quindi coltura le cellule a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica o integrazione di ossigeno.
Preparare 3 ml di ciascuno dei composti di prova nel mezzo di prova di stress mitocondriale. Caricare 25 microlitri di ciascun composto nelle porte dell'iniettore della cartuccia del sensore utilizzando una pipetta multicanale. Lo stato delle cellule e gli eventuali pretrattamenti possono influire sul massimo ripristino suscitato dall'iniezione di FCCP disaccoppiatore.
Anche la sensibilità cellulare al disaccoppiatore può cambiare, pertanto è fondamentale ottimizzare la concentrazione di lavoro di FCCP per ogni particolare trattamento. Successivamente, impostare il protocollo di dosaggio del flusso extracellulare e avviare il programma. In primo luogo, mettere il cartiridge del sensore nella macchina per la calibrazione.
Sostituire il calibrant per la piastra di dosaggio una volta eseguita la fase di calibrazione. Se lo si desidera, dopo il saggio, scartare accuratamente tutti i mezzi di dosaggio utilizzando una pipetta multicanale. E conservare la coltura cellulare mircoplato a -20 gradi celsius per la futura normalizzazione cellulare usando test proteici.
Usando il protocollo descritto, i cuori erano isolati dai cuccioli neo-natali del primo giorno e i cardiomiociti venivano seminati a densità di 10, 20 o 30 mila cellule per pozzo in piastre da 96 pozzi. Dopo la coltura notturna, i cardiomiociti sono stati trovati ben attaccati alla superficie plastica rivestita e c'erano pochissime cellule non attaccate. A questo punto, i cardiomiociti che si contraevano spontaneamente erano facilmente visibili.
Una densità di semina di 30.000 cellule per pozzo ha mostrato confluenza un giorno dopo la semina man mano che le cellule si diffondono. I cardiomiociti sono stati immunososteniati con un anticorpo contro l'alfa actinina sarcomerica, un marcatore specifico del cardiomiocita. Come mostrato qui, la maggior parte delle cellule ha mostrato una colorazione positiva dell'actina alfa che indica l'elevata purezza dell'isolamento cardiomiocita.
Qui viene mostrato uno schema di una tipica prova di stress mitocondriale. La prova di stress mitocondriale inizia con una misurazione della linea di base del tasso di consumo di ossigeno, seguita dall'iniezione di miosina di Oligo che inibisce l'ATPA. Quindi, l'agente di disaccoppiamento FCCP è stato iniettato per misurare il tasso massimo di consumo di ossigeno.
Infine, con l'iniezione di due inibitori complessi del trasporto elettronico, la respirazione mitocondriale si ferma completamente e l'OCR diminuisce al suo livello più basso. Per ottenere risultati coerenti e riproducibili. È fondamentale raggiungere un'elevata sopravvivenza.
Pertanto, è importante utilizzare neonati neonati e tessuti cardiaci delicatamente maneggiati nei cardiomiociti. Utilizzando linee di topo geneticamente manipolate nuove o esistenti, questo metodo può essere facilmente tradotto in dati che possono portare a comprendere nuovi meccanismi per la regolazione bioenergetica nel cuore. I mitocondriali svolgono un ruolo chiave nella funzione cardiaca.
Ci aspettiamo che questo metodo aiuti a identificare nuovi regolatori e percorsi che regolano il metabolismo ossidante e trovano nuovi obiettivi terapeutici per il trattamento dell'insufficienza cardiaca.
