Этот протокол позволяет изолировать и культуры высокой би-BBT, известный только мыши кардиомиоцитов. Для оценки митохондриальной функции, уровень потребления кислорода кардиомиоцитов может быть проанализирован фактическим анализатором потока серебра. Одним из преимуществ этого метода является то, что потребление кислорода кардиомиоцитов можно легко измерить в их адептном состоянии в формате 96-колодец, что позволяет тестировать несколько условий с большим количеством репликаций.
Это судно дает важное представление об исследовательской области кардиологии. В дополнение к потреблению кислорода, мы также можем изучить другие метаболические параметры, такие как серые сердики и перацидная эпоксидная эпоксидация. Достижение высокой изменчивости кардиомиоцитов имеет решающее значение для этого эксперимента.
Это требует эффективного пищеварения сердца. Поскольку неонатные кардиомиоциты очень хрупкие, мягкое обращение с кардиомиоцитами также имеет важное значение. В капюшоне культуры клетки, aliquot 5ml HBSS к каждому наилучшим образом плиты культуры клетки 6-хорошо и поместите ее на лед.
Кроме того, aliquot 10 мл HBSS к 10см клеточной культуры блюдо, то, подготовить 20 мл трипсина Predigestion раствор в 50 мл стерильной конической трубки. Храните все растворы на льду. Затем извлекайте сердце и немедленно перенесите его в стерильное блюдо клеточной культуры, содержащее HBSS.
Удалите остатки легочной ткани и более крупных сосудов. Вымойте сердце в HBSS с помощью нежного возбуждения. Впоследствии разрежьте сердце мелкими ножницами на 8 частей и перенесите сердечную ткань с типсами в один колодец 6-хорошо клеточной культуры пластины с HBSS.
Используя ложку мории, мыть ткани сердца, передавая его из хорошо хорошо в 6-хорошо пластины заполнены HBSS. Затем перенесите сердечную ткань в коническую трубку, содержащую 20 мл трипсина, и инкубировать с нежным возбуждением при 4 градусах цельсия в течение 4 часов. В этой процедуре, довоенная раствор пищеварения коллагеназы в водяной бане при 37 градусах по Цельсию.
Перенесите коническую трубку, содержащую сердечную ткань и раствор для предварительного потребления, с 4 градусов по Цельсию на капюшон клеточной культуры. Пусть ткани сердца опускаются на дно трубки и удалить раствор предварительного потребления с помощью 10 мл серологического пипетки. Затем добавьте 10 мл HBSS в трубку.
Повторное использование сердечной ткани с HBSS 2 до 3 раз, чтобы вымыть трипсин с помощью 10 мл серологической пипетки. Аспират HBSS и добавить 10 мл довоенной коллагеназы пищеварения раствор в трубку с сердечной ткани. Для первого пищеварения, инкубировать трубку с ткани сердца в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут без возбуждения.
После этого перенесите трубку на капот клеточной культуры. Тритурировать ткани, повторно используя его осторожно 10 раз с помощью 10 мл серологического пипетки. Это позволит сердцу разойтись и клетки, которые будут освобождены от сердечной ткани.
Пусть непереваренная ткань утонет. Перенесите переваренный раствор, обогащенный кардиомиоцитами, в новую коническую трубку и немедленно добавьте равное количество среды клеточной культуры, чтобы остановить пищеварение коллагеназы. Затем добавьте 10 мл раствора пищеварения коллагеназы в трубку, содержащую оставшуюся непереваренную сердечную ткань.
Для второго пищеварения, инкубировать трубку с сердечной ткани в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 10 минут. Повторите процедуры первого пищеварения и перенесите усваиваемый раствор, обогащенный кардиомиоцитами, в новую коническую трубку перед остановкой пищеварения коллагеназы. Затем поместите стерильный клеточный ситечко в новую стерильную коническую трубку 50 мл.
Предварительно влажный клеточный ситечко с 2 до 3 мл среды клеточной культуры и пройти клетки через ситечко клетки. Впоследствии, промойте ситечко клетки с средством культуры клетки. Затем центрифуга конической трубки, содержащей кардиомиоциты в течение 5 минут при 180-времени гравитации.
Через 5 минут, аспирировать супернатант и повторное течение клеток гранулы в 10 мл клеточной культуры среды. Плита клетки на 10см клеточной культуры блюдо и инкубировать их в течение одного часа. После этого осторожно агитировать тарелку.
Смойте непритеняемые клетки и resuspend клетки, неоднократно трубопроводов клеточной культуры среды над блюдом с помощью 10 мл серологической пипетки. Затем перенесите неприемные клетки в новое блюдо культуры клеток 10 см и инкубировать их еще на час. Через час осторожно агитировать тарелку и смыть неприемные клетки.
Перенесите кардиомиоциты в новую коническую трубку 50 мл. Далее, подготовить 96-хорошо культуры пластины путем aliquoting 50 микролитров покрытия раствора в каждом хорошо из 96-хорошо пластины культуры клеток. Если пузырьки присутствуют, удалите их с помощью 20 микролитров пипетки.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере один час, чтобы сушка матричного покрытия. Затем посчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Плита клеток в экстра-клеточной матрицы покрытием 96-хорошо пластины клеточной культуры при плотности от 10 до 30 тысяч клеток на колодец.
И поместите клетки в инкубационный. Чтобы предварительно проработать анализ потребления кислорода, увлажняйте картридж датчика датчика потока в течение не менее 3 часов, добавьте 200 микролитров раствора калибранта в каждую колодец полезной пластины. Поместите сенсорный картридж обратно на утилиту пластины и инкубировать в 37 градусов по Цельсию без CO2 или O2 добавок, по крайней мере 3 часа.
За час до анализа аккуратно удалите среду клеточной культуры и дважды промыте клетки 200 микролитров предварительной митохондриальной стресс-тестовой среды. После второй стирки добавьте 175 микролитров довоенной митохондриальной среды стресс-теста. Затем культуры клеток при 37 градусов по Цельсию без углекислого газа или кислорода добавок.
Подготовка 3 мл каждого из тестовых соединений в митохондриальной среде стресс-теста. Загрузите 25 микролитров каждого соединения в инжекторные порты сенсорного картриджа с помощью многоканарной пипетки. Состояние клеток и любые предварительные обработки могут повлиять на максимальное восстановление, вызванное инъекцией uncoupler FCCP.
Чувствительность клеток к uncoupler также может измениться, поэтому крайне важно оптимизировать рабочую концентрацию FCCP для каждого конкретного лечения. Впоследствии найте протокол анализа внеклеточного потока и запустите программу. Во-первых, положить датчик cartiridge в машину для калибровки.
Замените калибровку на анализную пластину после того, как будет сделан шаг калибровки. При желании, после анализа, тщательно отбросьте все анализы среды с помощью многоканаражной пипетки. И хранить миркоплат клеточной культуры при отрицательном 20 градусов по Цельсию для будущей нормализации клеток с использованием анализа белка.
Используя описанный протокол, сердца были изолированы от 0-го дня неонатальные щенки и кардиомиоциты были посеяны при плотности 10, 20 или 30 тысяч клеток на колодец в 96-хорошо пластин. После ночной культуры, кардиомиоциты были найдены хорошо прикреплены к покрытой пластиковой поверхности и было очень мало непривязанных клеток. В этот момент, спонтанно контракт кардиомиоцитов были легко видны.
Плотность посева 30 000 клеток на колодец показала слияние на следующий день после посева по мере распространения клеток. Кардиомиоциты были иммуноминистерами с антителом против саркомерного альфа актинина, кардиомиоцитов специфический маркер. Как показано здесь, большинство клеток показали положительное окрашивание альфа-актинина, указывающее на высокую чистоту изоляции кардиомиоцитов.
Здесь показана схема одного типичного митохондриального стресс-теста. Митохондриальный стресс-тест начинается с измерения базовой линии скорости потребления кислорода, за этим следует инъекция миозин олиго, который подавляет ATPA. Затем для измерения максимальной скорости потребления кислорода был введен размежевающий агент FCCP.
Наконец, с инъекцией двух ингибиторов электронного транспортного комплекса митохондриальное дыхание полностью прекращается, а OCR уменьшается до самого низкого уровня. Для получения последовательных и воспроизводимых результатов. Очень важно достичь высокой выживаемости.
Поэтому важно использовать новорожденных новорожденных и аккуратно обрабатывать ткани сердца в кардиомиоцитах. Используя новые или существующие генетически манипулируемые линии мыши, этот метод можно легко перевести на данные, которые могут привести к пониманию новых механизмов биоэнергетического регулирования в сердце. Митохондриальные играют ключевую роль в функции сердца.
Мы ожидаем, что этот метод поможет определить новые регуляторы и пути, регулирующие окисляющий метаболизм и найти новые терапевтические цели для лечения сердечной недостаточности.
