Dieses Protokoll ermöglicht es uns, hohe Bi-BBT zu isolieren und zu kulturieren, die nur Maus-Kardiomyozyten bekannt sind. Um die mitochondriale Funktion zu bewerten, kann die Sauerstoffverbrauchsrate von Kardiomyozyten mit einem tatsächlichen Silberflussanalysator analysiert werden. Einer der Vorteile dieser Technik ist, dass der Sauerstoffverbrauch von Kardiomyozyten leicht in ihrem Haftenzustand im 96-Well-Format gemessen werden kann, was das Testen mehrerer Bedingungen mit einer großen Anzahl von Replikationen ermöglicht.
Dieses Schiff bietet wichtige Einblicke in den Forschungsbereich der Kardiologie. Neben dem Sauerstoffverbrauch können wir auch andere metabolische Parameter wie Graugrizen und Peracid-Epoxidation untersuchen. Die Erreichung einer hohen Variabilität von Kardiomyozyten ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung.
Dies erfordert eine effiziente Verdauung der Herzen. Da neonatale Kardiomyozyten sehr zerbrechlich sind, ist auch der schonende Umgang mit Kardiomyozyten wichtig. In der Zellkulturhaube, aliquot 5ml von HBSS zu jedem Brunnen einer 6-Well-Zell-Kulturplatte und legen Sie es auf Eis.
Darüber hinaus aliquot 10ml HBSS zu einer 10cm Zellkulturschale, dann bereiten 20 ml Trypsin Predigestion Lösung in einem 50ml sterilen konischen Röhrchen. Halten Sie alle Lösungen auf Eis. Als nächstes extrahieren Sie das Herz und übertragen Sie es sofort auf die sterile Zellkulturschale, die HBSS enthält.
Entfernen Sie alle verbleibenden Lungengewebe und größere Gefäße. Waschen Sie das Herz in HBSS mit sanfter Rührung. Anschließend das Herz mit einer feinen Schere in 8 Stücke schneiden und das Herzgewebe mit Zangen in einen Brunnen einer 6-Well-Zellkulturplatte mit HBSS übertragen.
Mit einem Moria-Löffel, waschen Sie das Herzgewebe, indem Sie es von gut zu gut in der 6-Well-Platte mit HBSS gefüllt übertragen. Dann das Herzgewebe in eine konische Röhre mit 20ml Trypsin übertragen und mit sanfter Rührung bei 4 Grad Celsius für 4 Stunden brüten. Bei diesem Verfahren die Kollagenase-Verdauungslösung in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorwärmen.
Übertragen Sie die konische Röhre mit Herzgewebe und Präkondonsionslösung von 4 Grad Celsius auf eine Zellkulturhaube. Lassen Sie das Herzgewebe auf den Boden des Rohres sinken und entfernen Sie die Prädigestionslösung mit einer 10ml serologischen Pipette. Als nächstes fügen Sie 10ml HBSS in die Tube.
Setzen Sie das Herzgewebe mit HBSS 2 bis 3 Mal aus, um Trypsin mit einer 10ml serologischen Pipette auszuwaschen. ASpirieren Sie HBSS und fügen Sie 10ml vorgewärmte Kollagennase-Verdauungslösung in die Röhre mit Herzgewebe. Für die erste Verdauung, inkubieren Sie die Röhre mit Herzgewebe in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten ohne Rührung.
Anschließend übertragen Sie die Röhre auf die Zellkulturhaube. Trituieren Sie das Gewebe, indem Sie es mit einer 10ml serologischen Pipette 10ml sanft wieder aufhängen. Dies wird es dem Herzen ermöglichen, sich zu zerstreuen und die Zellen aus dem Herzgewebe zu lösen.
Lassen Sie das unverdaute Gewebe sinken. Übertragen Sie die in Kardiomyozyten angereicherte verdaute Lösung in eine neue konische Röhre und fügen Sie sofort eine gleiche Menge an Zellkulturmedium hinzu, um die Kollagenaseverdauung zu stoppen. Dann fügen Sie 10ml Kollagenase Verdauungslösung in die Röhre mit dem verbleibenden unverdautem Herzgewebe.
Für die zweite Verdauung, inkubieren Sie die Röhre mit Herzgewebe in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Verfahren der ersten Verdauung und übertragen Sie die in Kardiomyozyten angereicherte verdaute Lösung in eine neue konische Röhre, bevor Sie die Kollagenaseverdauung stoppen. Als nächstes legen Sie ein steriles Zellsieb in eine neue sterile 50ml konische Röhre.
Das Zellsieb mit 2 bis 3 ml Zellkulturmedium vorbefeuchten und die Zellen durch das Zellsieb leiten. Anschließend spülen Sie das Zellsieb mit Zellkulturmedium. Zentrifugieren Sie dann das konische Rohr, das Kardiomyozyten enthält, für 5 Minuten bei 180-facher Schwerkraft.
Nach 5 Minuten den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 10ml Zellkulturmedium wieder aufsetzen. Die Zellen auf eine 10cm Zellkulturschale aufstellen und eine Stunde lang bebrüten. Danach rühren Sie die Platte sanft auf.
Die nicht haftenden Zellen abwaschen und die Zellen wieder aufhängen, indem sie das Zellkulturmedium mit einer 10ml serologischen Pipette wiederholt über die Schale pfeifen. Dann übertragen Sie die nicht haftenden Zellen in eine neue 10cm Zellkulturschale und inkubieren Sie sie für eine weitere Stunde. Nach einer Stunde die Platte sanft aufrühren und die nicht haftenden Zellen abwaschen.
Übertragen Sie die Kardiomyozyten in eine neue 50ml konische Röhre. Als nächstes bereiten Sie eine 96-Well-Kulturplatte vor, indem Sie 50 Mikroliter Beschichtungslösung in jedem Brunnen der 96-Well-Zellkulturplatte aliquotieren. Wenn Blasen vorhanden sind, entfernen Sie sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde, um das Trocknen der Matrixbeschichtung zu ermöglichen. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer. Die Zellen in die extrazelluläre Matrix beschichtet 96-Well-Zellkulturplatte mit einer Dichte zwischen 10 bis 30 Tausend Zellen pro Brunnen.
Und legen Sie die Zellen in den Inkubater. Um den Sauerstoffverbrauch assay vorzuformen, hydratisieren Sie eine Flussanalysator-Sensorpatrone für mindestens 3 Stunden, fügen Sie 200 Mikroliter Kalibrant-Lösung in jeden Brunnen der Versorgungsplatte. Legen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Nutzplatte und brüten Sie in 37 Grad Celsius ohne CO2- oder O2-Supplementierung für mindestens 3 Stunden.
Eine Stunde vor dem Test, entfernen Sie vorsichtig die Zellkultur Medium und waschen Sie die Zellen mit 200 Mikroliter von vorgewärmten mitochondrialen Stresstest Medium zweimal. Nach der zweiten Wäsche 175 Mikroliter vorgewärmten mitochondrialen Stresstestmedium hinzufügen. Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid oder Sauerstoff-Supplementierung.
Bereiten Sie 3ml jeder der Testverbindungen in mitochondrialen Stresstestmedium. Laden Sie 25 Mikroliter jeder Verbindung mit einer Mehrkanalpipette in die Injektoranschlüsse der Sensorpatrone. Zustand der Zellen und alle Vorbehandlungen können die maximale Restauration durch Injektion von Entkoppler FCCP entsteht beeinflussen.
Die Zellempfindlichkeit gegenüber dem Entkoppler kann sich ebenfalls ändern, daher ist es wichtig, die Arbeitskonzentration von FCCP für jede einzelne Behandlung zu optimieren. Anschließend richten Sie das extrazelluläre Fluss-Assay-Protokoll ein und starten Sie das Programm. Legen Sie zunächst den Sensorknortrat zur Kalibrierung in die Maschine.
Ersetzen Sie das Kalibrant für die Assayplatte, sobald der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist. Falls gewünscht, nach dem Test, sorgfältig alle Assay-Medium mit einer Mehrkanal-Pipette zu entsorgen. Und speichern Sie die Zellkultur Mircoplate bei negativen 20 Grad Celsius für die zukünftige Zellnormalisierung mit Protein-Assay.
Durch die Verwendung des beschriebenen Protokolls wurden Die Herzen vom Tag 0 neonatale Welpen isoliert und Kardiomyozyten wurden bei Dichten von 10, 20 oder 30 Tausend Zellen pro Brunnen in 96-Well-Platten ausgesät. Nach der Nachtkultur wurden Kardiomyozyten gefunden, die gut an der beschichteten Kunststoffoberfläche befestigt waren, und es gab nur sehr wenige ungebundene Zellen. Zu diesem Zeitpunkt waren spontan kontranomyozyten leicht sichtbar.
Eine Saatdichte von 30.000 Zellen pro Brunnen zeigte einen Tag nach der Aussaat einen Zusammenfluss, während sich die Zellen ausbreiteten. Kardiomyozyten wurden mit einem Antikörper gegen sarcomeric alpha actinin, einem Kardiomyozyten-spezifischen Marker, immungefärbt. Wie hier gezeigt, zeigten die meisten Zellen eine positive Färbung von Alpha-Actinin, was auf die hohe Reinheit der Kardiomyozytenisolation hindeutet.
Hier wird ein Schema eines typischen mitochondrialen Stresstests gezeigt. Der mitochondriale Stresstest beginnt mit einer Basislinienmessung der Sauerstoffverbrauchsrate, gefolgt von der Injektion von Oligo-Myosin, die ATPas hemmt. Anschließend wurde das Entkopplungsmittel FCCP injiziert, um den maximalen Sauerstoffverbrauch zu messen.
Schließlich stoppt mit der Injektion von zwei Elektronentransport-Komplex-Inhibitoren die mitochondriale Atmung vollständig und OCR sinkt auf den niedrigsten Stand. Um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Es ist entscheidend, eine hohe Überlebensfähigkeit zu erreichen.
Daher ist es wichtig, neugeborene Neugeborene Neugeborene und sanft behandeltherzes Gewebe in Kardiomyozyten zu verwenden. Durch die Verwendung neuer oder vorhandener genetisch manipulierter Mauslinien kann diese Methode leicht in Daten übersetzt werden, die zum Verständnis neuer Mechanismen für die bioenergetische Regulierung im Herzen führen können. Mitochondrial spielen Schlüsselrollen in der Herzfunktion.
Wir erwarten, dass diese Methode dazu beiträgt, neue Regulatoren und Wege zu identifizieren, die den oxidierenden Stoffwechsel regulieren und neue therapeutische Ziele für die Behandlung von Herzinsuffizienz finden.
