Este protocolo nos permite isolar e cultivar alto bi-BBT, conhecido apenas pelos cardiomiócitos do rato. Para avaliar a função mitocondrial, a taxa de consumo de oxigênio dos cardiomiócitos pode ser analisada por um analisador de fluxo de prata real. Uma das vantagens dessa técnica é que o consumo de oxigênio de cardiomiócitos pode ser facilmente medido em seu estado de aderente em formato de 96 poços, o que permite o teste de múltiplas condições com um grande número de réplicas.
Esta embarcação fornece importantes insights sobre a área de pesquisa da cardiologia. Além do consumo de oxigênio, também podemos estudar outros parâmetros metabólicos, como agrices cinza e a epóxida peraciada. Alcançar alta variabilidade de cardiomiócitos é fundamental para este experimento.
Isso requer uma digestão eficiente dos corações. Uma vez que os cardiomiócitos neo-natal são muito frágeis, o manuseio suave de cardiomiócitos também é importante. Na capa de cultura celular, alíquota de 5ml de HBSS para cada poço de uma placa de cultura celular de 6 poços e colocá-lo no gelo.
Além disso, aliquot 10ml de HBSS para um prato de cultura celular de 10cm, em seguida, preparar 20 ml de solução de Predigestion Trypsin em um tubo cônico estéril de 50ml. Mantenha todas as soluções no gelo. Em seguida, extraia o coração e transfira-o imediatamente para o prato de cultura celular estéril contendo HBSS.
Remova qualquer tecido pulmonar residual e vasos maiores. Lave o coração no HBSS usando agitação suave. Posteriormente, corte o coração com uma tesoura fina em 8 pedaços e transfira o tecido cardíaco com fórceps em um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços com HBSS.
Usando uma colher de moria, lave o tecido cardíaco transferindo-o de poço para poço na placa de 6 poços cheia de HBSS. Em seguida, transfira o tecido cardíaco para um tubo cônico contendo 20ml de Trippsin e incubar com agitação suave a 4 graus celsius por 4 horas. Neste procedimento, pré-aquecimento a solução de digestão de colagenase em um banho de água a 37 graus celsius.
Transfira o tubo cônico contendo tecido cardíaco e solução de predileção de 4 graus celsius para uma capa de cultura celular. Deixe o tecido cardíaco afundar até o fundo do tubo e remova a solução de predileção usando uma pipeta sorológica de 10ml. Em seguida, adicione 10ml de HBSS no tubo.
Resuspenja o tecido cardíaco com HBSS 2 a 3 vezes para lavar a Trippsin usando uma pipeta sorológica de 10ml. Aspire HBSS e adicione 10ml de solução de digestão de colagem pré-w armada no tubo com tecido cardíaco. Para a primeira digestão, incubar o tubo com tecido cardíaco em um banho de água a 37 graus celsius por 10 minutos sem agitação.
Depois, transfira o tubo para o capô da cultura celular. Triturar o tecido reutilizando-o suavemente 10 vezes usando uma pipeta sorológica de 10ml. Isso permitirá que o coração se disperse e as células sejam liberadas do tecido cardíaco.
Deixe o tecido não digerido afundar. Transfira a solução digerida enriquecida em cardiomiócitos para um novo tubo cônico e adicione imediatamente uma quantidade igual de meio de cultura celular para parar a digestão da colagemnase. Em seguida, adicione 10ml de solução de digestão de colagenase no tubo contendo o tecido cardíaco não digerido restante.
Para a segunda digestão, incubar o tubo com tecido cardíaco em um banho de água de 37 graus celsius por 10 minutos. Repita os procedimentos da primeira digestão e transfira a solução digerida enriquecida em cardiomiócitos para um novo tubo cônico antes de parar a digestão da colagemnase. Em seguida, coloque um coador de células estéreis em um novo tubo cônico estéril de 50ml.
Pré-molhar o coador celular com 2 a 3 ml de meio de cultura celular e passar as células através do coador celular. Posteriormente, enxágue o coador celular com meio de cultura celular. Em seguida, centrífuga o tubo cônico contendo cardiomiócitos por 5 minutos a 180 vezes a gravidade.
Após 5 minutos, aspire o supernaspe e resuspense a pelota celular em 10ml de meio de cultura celular. Coloque as células em um prato de cultura celular de 10cm e incuba-as por uma hora. Depois, agitar suavemente o prato.
Lave as células não aderentes e resuspenja as células, encanar repetidamente o meio de cultura celular sobre o prato usando uma pipeta sorológica de 10ml. Em seguida, transfira as células não aderentes para um novo prato de cultura celular de 10cm e incuba-as por mais uma hora. Depois de uma hora, agitar suavemente a placa e lavar as células não aderentes.
Transfira os cardiomiócitos para um novo tubo cônico de 50ml. Em seguida, prepare uma placa de cultura de 96 poços, aliquoting 50 microliters de solução de revestimento em cada poço da placa de cultura celular de 96 poços. Se as bolhas estiverem presentes, remova-as usando uma pipeta de 20 microliter.
Incubar a placa a 37 graus celsius por pelo menos uma hora para permitir a secagem do revestimento da matriz. Em seguida, conte as células usando um hemótmetro. Coloque as células na matriz extra-celular revestida de placa de cultura celular de 96 poços a uma densidade entre 10 a 30 mil células por poço.
E coloque as células na incubadora. Para pré-formar o ensaio de consumo de oxigênio, hidrate um cartucho de sensor analisador de fluxo por pelo menos 3 horas, adicione 200 microliters de solução calibrante em cada poço da placa de utilidade. Coloque o cartucho do sensor de volta na placa do utilitário e incubar em 37 graus celsius sem suplementação de CO2 ou O2 por pelo menos 3 horas.
Uma hora antes do ensaio, remova suavemente o meio de cultura celular e lave as células com 200 microliters de meio de teste de estresse mitocondrial pré-armado duas vezes. Após a segunda lavagem, adicione 175 microliters de meio de teste de estresse mitocondrial pré-armado. Em seguida, cultura as células a 37 graus celsius sem dióxido de carbono ou suplementação de oxigênio.
Prepare 3ml de cada um dos compostos de teste no meio de teste de estresse mitocondrial. Carregue 25 microliters de cada composto nas portas injetoras do cartucho do sensor usando uma pipeta multicanal. O estado das células e quaisquer pré-tratamentos podem afetar a restauração máxima provocada pela injeção de fccp desacoplador.
A sensibilidade celular ao desacoplador também pode mudar, portanto, é fundamental otimizar a concentração de trabalho do FCCP para cada tratamento específico. Posteriormente, configure o protocolo de ensaio de fluxo extracelular e inicie o programa. Primeiro, coloque o sensor cartiridge na máquina para calibração.
Substitua o calibrante para a placa de ensaio quando a etapa de calibração for feita. Se desejar, após o ensaio, descarte cuidadosamente todo o meio de ensaio usando uma pipeta multicanal. E armazene a cultura celular mircopolando a 20 graus celsius negativos para futura normalização celular usando ensaio proteico.
Por meio do protocolo descrito, os corações foram isolados a partir do dia 0 filhotes neo-natal e cardiomiócitos foram semeados em densidades de 10, 20 ou 30 mil células por poço em placas de 96 poços. Após a cultura da noite para o dia, os cardiomiócitos foram encontrados bem ligados à superfície de plástico revestida e havia muito poucas células não ligadas. Neste ponto, cardiomiócitos que contraíam espontaneamente eram facilmente visíveis.
Uma densidade de semeadura de 30.000 células por poço mostrou confluência um dia após a semeadura à medida que as células se espalhavam. Os cardiomiócitos foram imunossuados com um anticorpo contra a actina alfa sarcomerica, um marcador específico de cardiomiócito. Como mostrado aqui, a maioria das células mostrou coloração positiva de alfa actinin indicando a alta pureza do isolamento cardiomiócito.
Um esquema de um típico teste de estresse mitocondrial é mostrado aqui. O teste de estresse mitocondrial começa com uma medição da linha base da taxa de consumo de oxigênio, seguida pela injeção de minosina Oligo que inibe atpa's. Em seguida, o agente de desacoplamento FCCP foi injetado para medir a taxa máxima de consumo de oxigênio.
Finalmente, com a injeção de dois inibidores complexos de transporte de elétrons, a respiração mitocondrial pára completamente e o OCR diminui para seu nível mais baixo. Para obter resultados consistentes e reprodutíveis. É fundamental alcançar alta sobrevivência.
Por isso, é importante usar recém-nascidos recém-nascidos e tecidos cardíacos manuseados suavemente em cardiomiócitos. Usando linhas de camundongos novas ou existentes geneticamente manipuladas, este método pode ser facilmente traduzido para dados que podem levar à compreensão de novos mecanismos para a regulação bioenergérica no coração. Mitocondrial desempenham papéis-chave na função cardíaca.
Esperamos que este método ajude a identificar novos reguladores e caminhos que regulam o metabolismo oxidante e encontrem novos alvos terapêuticos para o tratamento da insuficiência cardíaca.
