このプロトコルは、マウス心筋細胞にのみ知られている高いバイBBTを分離し、培養することを可能にする。ミトコンドリア機能を評価するために、心筋細胞の酸素消費率を実際の銀フラックス分析装置で解析することができます。この技術の利点の1つは、心筋細胞の酸素消費量が96ウェル形式で付着状態で容易に測定できることであり、多数の複製を伴う複数の条件のテストを可能にする。
この容器は心臓病学の研究分野に重要な洞察を提供する。酸素消費量に加えて、グレイグライスや過酸エポキシ化などの他の代謝パラメータも研究できます。心筋細胞の高いばらつきを達成することは、この実験にとって非常に重要です。
これは、心の効率的な消化を必要とします。新生児心筋細胞は非常に脆弱であるため、心筋細胞の穏やかな取り扱いも重要です。細胞培養フードにおいて、6ウェル細胞培養板の各ウェルにHBSSのアリコート5mlを氷の上に置いた。
さらに、10cm細胞培養皿に10mlのHBSSのアリコート10mlを、その後、50mlの滅菌円錐管に20mlのトリプシン前消化液を調製した。すべてのソリューションを氷の上に保管してください。次に、心臓を抽出し、HBSSを含む滅菌細胞培養皿に直ちに移す。
残留肺組織および大きな血管を除去する。穏やかな攪拌を使用してHBSSで心臓を洗います。その後、微細なはさみで心臓を8個に切断し、鉗子で心臓組織をHBSSで6ウェル細胞培養板の1つのウェルに移します。
モリアスプーンを使用して、HBSSで満たされた6ウェルプレートで心臓組織をよく移して心臓組織を洗います。その後、トリプシンの20mlを含む円錐形のチューブに心臓組織を移し、4°Cで穏やかな攪拌で4時間インキュベートする。この手順では、37°Cの水浴にコラゲレーター消化液を予熱する。
心臓組織と消化前溶液を含む円錐管を摂氏4度から細胞培養フードに移す。心臓組織をチューブの底に沈め、10mlの血清ピペットを使用して前消化液を取り除きます。次に、チューブに10mlのHBSSを加えます。
HBSSで心臓組織を2〜3回再中断し、10ml血清ピペットを使用してトリプシンを洗い流す。HBSSを吸引し、10mlのプレウォーム付きコラゲザーゼ消化液を心臓組織でチューブに加えます。最初の消化のために、37°Cの水浴で心臓組織とチューブを攪拌することなく10分間インキュベートします。
その後、チューブを細胞培養フードに移します。10ml血清ピペットを使用して10回穏やかに再懸濁して組織をトリチュレートする。これにより、心臓が分散し、細胞が心臓組織から放出されます。
未消化の組織を沈ませます。心筋細胞に富んだ消化溶液を新しい円錐形チューブに移し、即座に同量の細胞培養培地を加えてコラゲアーゼ消化を止める。その後、残りの未消化の心臓組織を含むチューブにコラゲターゼ消化液10mlを加える。
第二の消化のために、10分間摂氏37度の水浴で心臓組織とチューブをインキュベート。最初の消化の手順を繰り返し、コラゲナーゼ消化を停止する前に、心筋細胞で濃縮された消化溶液を新しい円錐形チューブに移します。次に、新しい滅菌50ml円錐管に無菌細胞ストレーナーを入れる。
細胞培養培地2〜3mlで細胞ストレーナーを予め湿潤し、細胞ストレーナーを通して細胞を通過させた。続いて、細胞培養培地で細胞ストレーナーをリンスする。次いで、心筋細胞を含む円錐管を180倍の重力で5分間遠心する。
5分後、上清を吸引し、細胞ペレットを10mlの細胞培養培地に再懸濁した。細胞を10cmの細胞培養皿に盛り付け、1時間インキュベートします。その後、プレートを軽く攪拌します。
非接着性細胞を洗い流し、10ml血清ピペットを使用して皿の上に細胞培養培地を繰り返しピペット化して細胞を再懸濁する。次に、非接着性細胞を新しい10cm細胞培養皿に移し、さらに1時間インキュベートする。1時間後、プレートを軽く攪拌し、非接着性細胞を洗い流します。
心筋細胞を新しい50ml円錐形チューブに移します。次に、96ウェル細胞培養板の各ウェルに50マイクロリットルのコーティング液をアリクォートして96ウェル培養板を調製する。気泡が存在する場合は、20マイクロリットルのピペットを使用してそれらを除去します。
マトリックスコーティングの乾燥を可能にするために、少なくとも1時間は摂氏37度でプレートをインキュベートします。次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。細胞を細胞外マトリックスにプレートし、ウェルあたり10〜30,000個の細胞の密度で96ウェルの細胞培養プレートをコーティングします。
そして、インキュベーターに細胞を置きます。酸素消費アッセイをプリフォームするには、フラックスアナライザのセンサカートリッジを少なくとも3時間水和し、200マイクロリットルのキャリブラント溶液をユーティリティプレートの各ウェルに加えます。センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻し、CO2またはO2の補充なしで37°Cで少なくとも3時間インキュベートします。
アッセイの1時間前に、細胞培養培地を穏やかに除去し、200マイクロリットルのプリウォームミトコンドリアストレス試験培地で細胞を2回洗浄する。2回目の洗浄後、175マイクロリットルのプリウォームミトコンドリアストレステスト培地を加える。その後、二酸化炭素や酸素補給なしで摂氏37度で細胞を培養します。
ミトコンドリアストレス試験培地で各試験化合物を3mlずつ調製した。マルチチャンネルピペットを使用して、各化合物の25マイクロリットルをセンサーカートリッジのインジェクタポートにロードします。細胞の状態および任意の前処理は、非結合性FCCPの注入によって引き出される最大の修復に影響を与える可能性がある。
アンカプラに対する細胞感受性も変化し得るため、特定の治療ごとにFCCPの働き濃度を最適化することが重要である。その後、細胞外フラックスアッセイプロトコルを設定し、プログラムを開始します。まず、キャリブレーションのためにセンサーのカルティリッジを機械に入れます。
キャリブレーションが完了したら、アッセイプレートのキャリブラントを交換します。必要に応じて、アッセイ後、マルチチャネルピペットを用いてすべてのアッセイ媒体を慎重に廃棄する。そして、タンパク質アッセイを用いた細胞正常化のために、細胞培養ミルコプレートをマイナス20°Cで保存します。
記載されたプロトコルを用いて、心臓を0日目から単離した新生児の子犬および心筋細胞を、96ウェルプレートのウェルあたり10、20、または30千個の密度で播種した。一晩培養した後、心筋細胞はコーティングされたプラスチック表面によく付着していることが判明し、未結合の細胞はほとんどなかった。この時点で、自然収縮心筋細胞は容易に見えうる。
1ウェルあたり30,000個の細胞の播種密度は、細胞が広がるにつれて播種した翌日に合流を示した。心筋細胞は、心筋細胞特異的マーカーである肉体αアクチニンに対する抗体で免疫染色した。ここに示すように、細胞の大部分は、心筋細胞単離の高純度を示すαアクチニンの陽性染色を示した。
典型的なミトコンドリアストレステストのスキームがここに示されています。ミトコンドリアストレス試験は酸素消費率の基線測定から始まり、続いてATPAを阻害するオリゴミオシンの注入が続く。次いで、最大酸素消費率を測定するために、非結合剤FCCPを注入した。
最後に、2つの電子輸送複合体阻害剤の注入により、ミトコンドリア呼吸は完全に停止し、OCRは最も低いレベルに低下する。一貫した再現性のある結果を得る。高い生存を達成することが重要です。
したがって、新生児を使用し、心筋細胞で心臓組織を穏やかに処理することが重要です。新しいまたは既存の遺伝的に操作されたマウスラインを使用することにより、この方法は、心臓の生体エネルギー調節のための新しいメカニズムを理解することにつながる可能性のあるデータに簡単に変換することができます。ミトコンドリアは心臓機能において重要な役割を果たす。
この方法は、新しい調節因子や、新しい代謝を調節する経路を特定し、心不全を治療するための新しい治療目標を見つけるのに役立つと期待しています。
