이 프로토콜은 마우스 심근세포에만 알려진 높은 이중 BBT를 분리하고 배양할 수 있게 합니다. 미토콘드리아 기능을 평가하기 위해 심근세포의 산소 소비율은 실제 은 플럭스 분석기로 분석될 수 있다. 이 기술의 장점 중 하나는 심근세포의 산소 소비가 96웰 형식으로 그들의 부착 상태에서 쉽게 측정될 수 있다는 것입니다, 이는 많은 수의 복제와 함께 여러 조건의 테스트를 가능하게 합니다.
이 혈관은 심장학의 연구 영역에 중요한 통찰력을 제공합니다. 산소 소비 이외에, 우리는 또한 다른 신진 대사 매개 변수를 연구할 수 있습니다., 그레이 그리스와 과산 편산화 등. 심근 세포의 높은 가변성을 달성하는 것은이 실험에 대 한 중요 한.
이를 위해서는 마음의 효율적인 소화가 필요합니다. 신생아 심근세포는 매우 깨지기 때문에 심근세포의 부드러운 취급도 중요합니다. 세포 배양 후드에서, 6웰 세포 배양 판의 각 웰에 HBSS의 알리쿼트 5ml를 알리쿼트하고 얼음에 놓습니다.
또한, 10cm 세포 배양 접시에 HBSS 10ml를 알리쿼트한 다음, 50ml멸균 원추형 튜브에 트립신 전소화식 용액 20ml를 준비한다. 모든 솔루션을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 심혼을 추출하고 HBSS를 포함하는 멸균 세포 배양 접시로 즉시 이송한다.
잔류 폐 조직과 더 큰 혈관을 제거하십시오. 부드러운 동요를 사용하여 HBSS에서 심장을 씻으시면 됩니다. 그 후, 미세 한 가위로 심혼을 8개로 자르고, HBSS를 가진 6웰 세포 배양 판의 한 우물로 집게로 심장 조직을 전송합니다.
모리아 숟가락을 사용하여 HBSS로 채워진 6 웰 플레이트에서 잘 전달하여 심장 조직을 씻어 내보도록 하십시오. 그런 다음 심장 조직을 트립신 20ml를 포함하는 원추형 튜브로 옮기고 4 시간 동안 섭씨 4도에서 부드러운 교반으로 배양하십시오. 이 절차에서 콜라게나아제 소화 용액을 섭씨 37도에서 수조에 미리 데우겠습니다.
심장 조직과 소화 전 용액을 함유 한 원적 튜브를 섭씨 4도에서 세포 배양 후드로 옮는다. 심장 조직이 튜브의 바닥에 가라 앉게하고 10ml 세로지 피펫을 사용하여 소화 전 용액을 제거하십시오. 다음으로, 튜브에 10ml의 HBSS를 추가합니다.
10ml 세로지피펫을 사용하여 트립신을 씻어 내기 위해 HBSS2 에서 3 번 심장 조직을 다시 중단합니다. HBSS를 흡인하고 심장 조직으로 튜브에 미리 따뜻해지는 콜라게나아제 소화 용액 10ml를 추가합니다. 첫 번째 소화를 위해, 동요없이 10 분 동안 37 섭씨 37도에서 수조에 심장 조직으로 튜브를 배양하십시오.
그 후, 튜브를 세포 배양 후드로 이송한다. 10ml 세로지 피펫을 사용하여 10회 부드럽게 다시 페일링하여 조직을 트리투레이합니다. 이것은 심장이 분산하고 세포가 심장 조직에서 풀어 놓일 수 있게 합니다.
소화되지 않은 조직이 가라앉도록 하십시오. 심근세포에 농축된 소화된 용액을 새로운 원내 튜브로 옮기고 즉시 동일한 양의 세포 배양 배지를 추가하여 콜라게나아제 소화를 막습니다. 그런 다음 10ml의 콜라게나아제 소화 용액을 나머지 소화되지 않은 심장 조직을 포함하는 튜브에 추가합니다.
두 번째 소화를 위해 10 분 동안 37섭씨 수조로 심장 조직으로 튜브를 배양하십시오. 첫 번째 소화의 절차를 반복하고 콜라게나아제 소화를 중지하기 전에 심근 세포에 농축 된 소화 된 용액을 새로운 원적 튜브로 옮춥시다. 다음으로 멸균 세포 스트레이너를 새로운 멸균 50ml 원문 튜브에 놓습니다.
세포 배양 배지의 2 ~ 3 ml로 세포 스트레이너를 미리 적시고 세포 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 이어서, 세포 배양 배지로 세포 스트레이너를 헹구는다. 그런 다음, 180배의 중력에서 5분 동안 심근세포가 함유된 원심관을 원심분리합니다.
5 분 후, 슈퍼 내수를 흡인하고 세포 배양 배지의 10ml에서 세포 펠릿을 재놓습니다. 세포를 10cm 세포 배양 접시에 접시에 접시를 매고 1 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 부드럽게 접시를 동요.
10ml 세로지피펫을 사용하여 접시 위에 세포 배양 배지를 반복적으로 피펫하여 비 부착 세포를 씻어 내고 세포를 재차단합니다. 그런 다음, 비 부착 세포를 새로운 10cm 세포 배양 접시로 옮기고 다른 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 부드럽게 접시를 동요하고 비 부착 세포를 씻어.
심근세포는 새로운 50ml 원내 튜브로 옮킨다. 다음으로, 96웰 세포 배양판의 각 웰에 50마이크로리터의 코팅 용액을 알리싱하여 96웰 배양판을 준비한다. 거품이 있는 경우 20 마이크로리터 파이펫을 사용하여 제거합니다.
매트릭스 코팅의 건조를 허용하기 위해 적어도 한 시간 동안 37섭씨에서 플레이트를 배양한다. 그런 다음 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포를 초세포 매트릭스로 플레이트하여 96웰 세포 배양판을 웰당 10~30,000개의 밀도로 코팅한다.
그리고 인큐베이터에 세포를 배치합니다. 산소 소비 분석을 제거하려면 플럭스 분석기 센서 카트리지를 최소 3시간 동안 수화하고, 200마이크로리터의 교정용액을 유틸리티 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 놓고 CO2 또는 O2 보충 없이 섭씨 37도에 적어도 3시간 동안 배양하십시오.
분석 1시간 전에, 세포 배양 배지를 부드럽게 제거하고 전동미토콘드리아 응력 시험 배지의 200 마이크로리터로 세포를 세척한다. 두 번째 세척 후, 미리 따뜻해진 미토콘드리아 응력 테스트 배지의 175 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 이산화탄소 나 산소 보충제없이 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
미토콘드리아 응력 시험 배지에서 각 시험 화합물 3ml를 준비한다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 화합물의 25 마이크로리터를 센서 카트리지의 인젝터 포트에 로드합니다. 세포의 상태 와 모든 전처리는 비커플러 FCCP의 주입에 의해 유도 된 최대 복원에 영향을 미칠 수 있습니다.
분리제에 대한 세포 민감도도 변경될 수 있으므로 각 특정 치료에 대해 FCCP의 작업 농도를 최적화하는 것이 중요합니다. 그 후, 여분의 세포 플럭스 분석 프로토콜을 설정하고 프로그램을 시작합니다. 먼저 센서 카테리리지를 장비에 넣어 교정합니다.
교정 단계가 완료되면 분석 플레이트의 교정판을 교체하십시오. 원하는 경우, 분석 후, 신중하게 멀티 채널 파이펫을 사용하여 모든 분석 매체를 폐기. 그리고 단백질 분석체를 사용하여 향후 세포 정상화를 위해 세포 배양 미코플레이트를 음수 20도에 저장합니다.
설명된 프로토콜을 사용하여, 심혼은 96웰 플레이트에서 웰 당 10, 20 또는 30,000세포의 밀도에서 종자 및 심근세포0일로부터 분리되었다. 하룻밤 배양 후, 심근세포는 코팅된 플라스틱 표면에 잘 부착되어 있고 부착되지 않은 세포가 거의 없었다. 이 시점에서, 자발적으로 수축 심근 세포 쉽게 볼 수 있었다.
잘 당 30, 000 세포의 파종 밀도는 세포가 퍼지면서 파종 후 하루 만에 합류를 보였다. 심근세포는 육종 알파 액틴, 심근세포 특이적 마커에 대한 항체로 면역염색되었다. 여기에 도시된 바와 같이, 대부분의 세포는 심근세포 분리의 높은 순도를 나타내는 알파 액틴의 양성 얼룩을 보였다.
하나의 전형적인 미토콘드리아 스트레스 테스트의 계획은 여기에 표시됩니다. 미토콘드리아 스트레스 테스트는 산소 소비율의 기본 선 측정으로 시작하여 ATPA를 억제하는 올리고 묘신의 주입에 따른다. 이어서, 분리제 FCCP는 최대 산소 소비속도를 측정하기 위해 주입되었다.
마지막으로, 두 개의 전자 수송 복합 억제제의 주입으로, 미토콘드리아 호흡은 완전히 중지하고 OCR은 가장 낮은 수준으로 감소. 일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면. 높은 생존을 달성하는 것이 중요합니다.
따라서 신생아를 사용하고 심근세포에서 심장 조직을 부드럽게 처리하는 것이 중요합니다. 새로운 또는 기존 유전자 조작 마우스 라인을 사용 하 여, 이 방법은 쉽게 심장에 생물 에너지 조절에 대 한 새로운 메커니즘을 이해로 이어질 수 있는 데이터로 번역 될 수 있습니다. 미토콘드리아는 심장 기능에서 중요한 역할을 합니다.
우리는 이 방법이 신진대사를 산화하고 심부전 을 치료하기 위한 새로운 치료 목표를 찾는 새로운 규제 기관 및 통로를 식별하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.
