המטרה הכוללת של פרוטוקול הניסוי הבא, היא לבצע טיפול פוטוביומודולציה transcranial באמצעות רמות נמוכות של לייזר אדום בעכברים. זה מושגת על ידי מגע ישיר של בדיקה לייזר על ראש העכבר. כצעד ראשון, על מנת הערכה של העברת אור הלייזר, בזהירות לנתח את רקמת המוח מתוך הגולגולת.
ואז למדוד את כוח האור המועבר דרך הגולגולת בתוספת הקרקפת ופרוסה אחת מילימטר של רקמת המוח. בסעיף הטיפול, צור קשר עם קצה גשוש הלייזר ישירות על הקרקפת בברגמה. פונקציות למידה מרחבית וזיכרון זה מוערכים על ידי משימת מבוך בארנס.
לאחר מכן, רמות ה-ATP בהיפוקמפוס נקבעות על פי השיטה הספקטרופוטומטרית. נתוני העברת לייזר מראים כי כ -1% מהאור הקדמון על פני הקרקפת הגיע לעומק של מילימטר אחד מפני השטח של קליפת המוח. התוצאות של המשימה מבוך בארנס להראות שיפור של הזיכרון המרחבי בעכברים בגילאי לאחר שבועיים של טיפול לייזר אדום transcranial.
כמו כן, התוצאות מצביעות על רמות גבוהות יותר של ATP בהיפוקמפוס בעכברים בגילאי לייזר. פוטוביומודולציה טרנס-cranial היא גישה טיפולית לא פולשנית לטיפול במגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות לשיפור תפקוד המוח הבריא. אכן, הוא האמין כי טיפול פוטוביומודולציה גורם פוטודיסוציאציה של תחמוצת החנקן מן הציטוכרום c אוקסידזה במיטוכונדריה.
אלה בתורם הגדלת הובלת אלקטרונים mitrochondrial, אשר בסופו של דבר מוביל לעלייה בייצור ATP. שיטה זו היא גישה בטוחה וחסכונית לאספקת אור המבוצעת על ידי קרינת הראש באמצעות מקורות אור חיצוניים כולל לייזרים ודיודות פולטות אור. כמעט כל נהלי פוטוביומודולציה transcranial מוחלים עם אור אדום כמעט אינפרא אדום באורך גל מ 600 כדי 1100 ננומטר, כוח הנע בין אחד ל 500 מיליוואט, ואת השטף הנע בין 1 ל 20 joule לכל סנטימטר מרובע.
בעכבר הרדמה עמוקה, בזהירות לנתח את רקמת המוח מתוך הגולגולת. ראשית, לתקן את רקמת המוח שלם על ג'ל אגרוז ולהכין את כל החומרים הדרושים כולל נתרן כלורי ודבק. לאחר מכן, להפיץ שכבה דקה של דבק על פני השטח של בלוק הרכבה רטט.
בזהירות לצרף את בלוק agarose ולהתאים את המיקום שלה. התאם מעט את להב הרטט לפני השטח העליונים של הבלוק, והקליט את ערך המונה. מלאו את מיכל הרטט בתמיסת מלח רגילה קרה כקרח.
כוונן את המהירות ואת תדירות הרטט של הרטט, ושנה את המונה לערך המתאים להשגת עובי פרוסה של מילימטר אחד. הפעל את הרטט ואת לחץ על כפתור ההתחלה וחתך את המוח רוחבי לפרוסה בעובי של מילימטר אחד. ראשית, מוסיפים טיפת מים על משטח הזכוכית האופטית.
לאחר מכן, שים את פרוסת המוח על הזכוכית. מוסיפים עליו את טיפת המים, ומ מניחים בזהירות את הזכוכית האופטית השנייה. שימו לב שיש להוסיף טיפת מים לגבולות המדגם והזכוכית כדי למנוע ייבוש רקמות וגם פיזור קל ממשטחים מחוספסים.
העבר דגימות למעבדה האופטית. הגדר את ההתקנים האופטיים והפעיל את מד הכוח. ללבוש משקפי הגנה על העיניים לפני שמתחילים לפעול עם מכשיר הלייזר.
הפעילו את הלייזר והתמקדו במראה להנחיית הקרן לאזור הפעיל של הפוטודיודה. ראשית, מניחים שתי משקפיים אופטיים ריקים על פני השטח של מד הכוח, ולקרוא את כוח האור המשודר ממסך התצוגה. הסר את המשקפיים הריקים והצב בעדינות את דגימת המוח על פני השטח של מד הכוח, וממקד את הקרן באזור המתאים של הרקמה, וקרא את הכוח המועבר.
הפעם, מניחים זכוכית אופטית ריקה על פני השטח של מד הכוח ולקרוא את כוח האור המועבר. לאחר מכן, להסיר את הזכוכית הריקה מעט למקם זכוכית אופטית עם גולגולת טרייה רקמה קרקפת על פני השטח של מד הכוח. למקד את הקרן על bregma ולקרוא את הכוח המועבר.
לבסוף, כבה את התקן הלייזר ואת מד הכוח. סעיף הטיפול בפרוטוקול הנוכחי כולל את היישום של מכשירי הלייזר Class 3B וזה דורש הדרכה נכונה והנחיות בטיחות. על מנת להתאים את בעלי החיים לסביבה החדשה, הביאו עכברים מכלובי הבית שלהם לחדר הטיפולים כ-20 דקות לפני תחילת הטיפול.
ראשית, הכנס את תקע התקן הלייזר למגן חשמלי. מכסים את קצה גשושית הלייזר בסרט ניילון שקוף כדי למנוע שריטות על משטח הגשוש. בזהירות לחבר את בדיקה לייזר לערוץ של המכשיר.
ללבוש משקפי הגנה על העיניים לפני שמתחילים לפעול עם מכשיר הלייזר. הפעל את התקן הלייזר והמתן מספר שניות לחימום שלו. לאחר התבוננות בשלט Laser Ready בלוח המכשיר, התאימו את פרמטרי הטיפול כולל זמן הקרנה ואופן פעולה.
לפני תחילת הטיפול, לקבוע את הכוח הממוצע לייזר על ידי יצירת קשר עם קצה החללית לאזור הפעיל של מד הכוח על המכשיר. בפרוטוקול הנוכחי, גשושית הלייזר ממוקמת על אזור ברגמה, שהוא כשלושה מילימטר rostral לקו שצויר בין הבסיס הקדמי של האוזניים. על מנת למנוע קרינה ישירה לעיני החיה, ראשית, מניחים את קצה גשושית הלייזר על הראש, ולאחר מכן מפעילים את הלייזר ומחזיקים את החללית עד להשלמת ההקרנה.
לאחר מכן, כבה את התקן הלייזר ונתק את הגשושית מהמכשיר. בסוף ההליך, לנקות את החללית לייזר עם מנקה אופטי המתאים. משימת הלמידה והזיכרון המרחבית מתבצעת במבוך בארנס.
ראשית, מקם את השלט אל תיכנס בצד החיצוני של דלת חדר המשימות. חבר רמזים מרחביים חזותיים לקירות ההיקפיים. מקם מצלמת וידאו מעל פלטפורמת המבוך.
נקה את פני השטח של פלטפורמת המבוך עם 70% אתנול על מנת להסיר רמזי חוש הריח לא רצויים. מוסיפים כמות קטנה של מצעים מכלוב הבית של החיה לתוך תיבת הבריחה כדי לשמש כסימן חוש הריח. לפני תחילת המשימה, לשים כל עכבר בכלוב החדש, ולהעביר את הכלוב לחדר מבוך בארנס.
כדי להתרגל, לאפשר את החיה להישאר בחדר במשך 30 דקות לפני המשימה. לאחר מכן, להסיר את העכבר מהכלוב שלה בעדינות למקם את החיה בתיבת המילוט, ולאפשר לו להישאר שם במשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, מוציאים בעדינות את העכבר מתיבת המילוט, מניחים את החיה במרכז הזירה, ומניחים עליה את תא ההתחלה.
לאחר תקופה של עשר שניות, הרם את תא ההתחלה ואפשר לחיה לחקור את הזירה במשך שלוש דקות. לעבור בשקט לאזור המחשב, ללבוש אטמי אוזניים, ולהפעיל גירוי שמיעתי שלילי המורכב רעש לבן חזק. לאחר מכן, התחל צילם וידאו והתבונן בהתנהגות של בעלי חיים בצג המחשב.
שים לב שיש להשתמש במבוך שחור לבדיקת עכברים לבנים. כמו כן, מחצלת שחורה צריכה להיות ממוקמת מתחת למבוך בתוכנת מערכת מעקב מקרה יש להשתמש. הגדר את תוכנת מעקב וידאו ולחלץ את הפרמטרים של עניין מן קטעי וידאו מוקלטים.
להערכה ביוכימית, לנתח רקמות ההיפוקמפוס, הומוגניזציה אותם במאגר מדגם, צנטריפוגה זה, ולאחר מכן להעריך את רמות ATP שלה באמצעות השיטה הספקטרופוטומטרית. שידור אור לייזר 660 ננומטר דרך הגולגולת בתוספת הקרקפת של העכברים בגילאי היה כ 16%גם, הערך של כ 10% נמדד כמשדר לייזר באמצעות פרוסה מילימטר אחד של רקמת המוח בגיל. לא היו הבדלים מובהקים סטטיסטית ביומן הפעילות המוטורית במבחן השדה הפתוח בין כל קבוצות הניסוי.
נתונים ממשימה מבוך בארנס הראו כי זמני ההשהיה של חיות הבקרה בגילאים הם כמובן ארוכים יותר מאלה של קבוצת הביקורת הצעירה ביום השלישי והרביעי של האימון. עם זאת, טיפול הלייזר האדום הפחית באופן משמעותי את זמן ההשהיה ביום הרביעי. במפגש ניסוי האביזרים, חיות בקרה מיושנות מבלים זמן קצר משמעותית ברביע היעד בהשוואה לחיות השליטה הצעירות.
עם זאת, העכברים בגילאי לייזר בילו זמן רב יותר באופן משמעותי ברבעי היעד בהשוואה לעכברי בקרה מיושנים. נתוני הביו-אנרגטיקה של ההיפוקמפוס חושפים ירידה ברמות ה-ATP בבעלי החיים המזדקן. מצד שני, טיפול הלייזר האדום מגדיל באופן משמעותי את תכולת ATP הממוצעת בהיפוקמפוס של העכברים בגילאים.
תיארנו פרוטוקול למעבדה המבצעת הליך טיפול פוטוביומודיאלי טרנס-cranial בעכברים. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לכל חיות מעבדה אחרות המשמשות לעתים קרובות בתחום מדעי המוח התרגומיים, כגון ארנב, כלב, קוף וכו '. בהתבסס על החקירה שלנו, רמות נמוכות של אור אדום יכול לשחזר חוסר תפקוד ההיפוקמפוס במוח בגיל על ידי האצת ייצור ATP, אשר משתקף בתפקוד זיכרון מרחבי משופר.
בשיטה זו, המבוססת על אילו אזורי מוח הם השפיעו על ידי פתולוגיה, מספר פרמטרים פיזיים וטיפוליים, כולל זמן הקרנה, מרווח טיפול, זוהר יישומי, ושטף, נדרשים להיות מותאמים באופן אופטימלי כדי להשיג תוצאות טובות יותר. טיפול פוטוביומודולציה transcranial מוצע כגישה מבטיחה לשיפור חילוף החומרים במוח ושיפור קוגניטיבי שיכול להיות אסטרטגיה פוטנציאלית עבור ירידה קוגניטיבית הקשורות לגיל ומחלות ניווניות.
