O objetivo geral do seguinte protocolo experimental é realizar uma terapia fotobiomodulação transcranária usando baixos níveis de laser vermelho em camundongos. Isso é feito pelo contato direto da sonda laser na cabeça do mouse. Como primeiro passo, a fim de avaliar a transmissão de luz laser, dissecar cuidadosamente o tecido cerebral do crânio.
E então meça a energia de luz transmitida através do crânio mais o couro cabeludo e uma fatia milimétrica do tecido cerebral. Na seção de terapia, entre em contato com a ponta da sonda laser diretamente no couro cabeludo no bregma. Esta aprendizagem espacial e funções de memória são avaliadas pela tarefa do labirinto de Barnes.
Posteriormente, os níveis atp de hipocampo são determinados pelo método espectrofotométrico. Dados de transmissão a laser mostram que aproximadamente 1% da luz antecedente na superfície do couro cabeludo atingiu uma profundidade milimétrica da superfície cortical. Os resultados da tarefa do labirinto barnes mostram uma melhoria da memória espacial nos camundongos idosos após duas semanas do tratamento a laser vermelho transcranário.
Além disso, os resultados sugerem um aumento dos níveis de ATP hipocampal nos camundongos idosos tratados a laser. A fotobiomodulação transcranária é uma abordagem terapêutica não invasiva para o tratamento de uma ampla gama de distúrbios neurológicos e psiquiátricos e para melhorar a função cerebral saudável. De fato, acredita-se que a terapia de fotobiomodulação causa fotodissociação do óxido nítrico do citocromático c oxidase nas mitocôndrias.
Estes, por sua vez, aumentam o transporte de elétrons mitrocondriais, o que acaba levando a um aumento na produção de ATP. Este método é uma abordagem de entrega de luz segura e econômica que é realizada pela radiação da cabeça usando fontes de luz externas, incluindo lasers e diodos emissores de luz. Quase todos os procedimentos de fotobiomodulação transcranária são aplicados com luz vermelha a quase infravermelha no comprimento de onda de 600 a 1100 nanômetros, uma potência que varia de um a 500 miliwatts, e a fluência variando de um a 20 joule por centímetro quadrado.
Em um rato profundamente anestesiado, disseca cuidadosamente o tecido cerebral do crânio. Primeiro, conserte o tecido cerebral intacto em um gel de agarose e prepare todos os materiais necessários, incluindo cloreto de sódio e cola. Em seguida, espalhe uma fina camada de cola na superfície do bloco de montagem do vibratome.
Conecte cuidadosamente o bloco de agarose e ajuste sua posição. Combine ligeiramente a lâmina vibratome com a superfície superior do bloco e regissão o valor do contador. Encha o tanque de vibratome com solução salina normal gelada.
Ajuste a velocidade e a frequência de vibração do vibratome e altere o contador para o valor apropriado para obter uma espessura de fatia de um milímetro. Ligue o vibratome e o botão de partida e corte o cérebro transversalmente em uma fatia com uma espessura de um milímetro. Primeiro, adicione uma gota de água na superfície óptica do vidro.
Então, coloque a fatia cerebral no vidro. Adicione a gota d'água sobre ele, e coloque cuidadosamente o segundo vidro óptico. Observe que uma gota de água deve ser adicionada aos limites de amostra e vidro, a fim de evitar a secagem de tecidos e também a dispersão de luz de superfícies ásperas.
Transfira amostras para o laboratório óptico. Configure os dispositivos ópticos e ligue o medidor de energia. Use óculos de proteção ocular antes de começar a operar com o dispositivo laser.
Ligue o laser e tenha o feixe focado no espelho para guiar o feixe até a área ativa do fotodiodo. Primeiro, coloque dois óculos ópticos em branco na superfície do medidor de energia e leia a energia de luz transmitida da tela de exibição. Remova os óculos em branco e coloque suavemente a amostra cerebral na superfície do medidor de energia, e concentre o feixe na respectiva área do tecido, e leia a energia transmitida.
Desta vez, coloque um vidro óptico em branco na superfície do medidor de energia e leia a energia da luz transmitida. Em seguida, remova o vidro em branco e coloque ligeiramente um vidro óptico com crânio fresco e tecido escalpelado na superfície do medidor de energia. Concentre o feixe no bregma e leia a energia transmitida.
Finalmente, desligue o dispositivo laser e o medidor de energia. A seção de terapia do protocolo atual inclui a aplicação dos instrumentos laser classe 3B e isso requer orientações adequadas de treinamento e segurança. Para adaptar os animais ao novo ambiente, leve os ratos de suas gaiolas para a sala de terapia aproximadamente 20 minutos antes de iniciar o tratamento.
Primeiro, insira o dispositivo laser plug em um protetor elétrico. Cubra a ponta da sonda laser com uma filme de nylon transparente, a fim de evitar qualquer arranhão na superfície da sonda. Conecte cuidadosamente a sonda laser ao canal do dispositivo.
Use óculos de proteção ocular antes de começar a operar com o dispositivo laser. Ligue o dispositivo laser e espere alguns segundos para o aquecimento. Depois de observar o sinal de pronto a laser no painel do dispositivo, ajuste os parâmetros de tratamento, incluindo tempo de irradiação e modo de operação.
Antes de iniciar o tratamento, determine a potência média do laser entrando em contato com a ponta da sonda para a área ativa do medidor de energia no dispositivo. No protocolo atual, a sonda laser é colocada na zona de bregma, que é aproximadamente três milímetros rostral para uma linha desenhada entre a base anterior das orelhas. Para evitar radiação direta aos olhos do animal, primeiro, coloque a ponta da sonda laser na cabeça, depois ligue o laser e segure a sonda até a conclusão da irradiação.
Em seguida, desligue o dispositivo laser e desconecte a sonda do dispositivo. No final do procedimento, limpe a sonda laser com um limpador óptico adequado. A tarefa de aprendizagem espacial e memória é realizada em um labirinto de Barnes.
Primeiro, coloque o sinal de não digitar na porta externa da sala de tarefas. Anexar pistas espaciais visuais às paredes do perímetro. Posicione uma câmera de vídeo acima da plataforma do labirinto.
Limpe a superfície da plataforma do labirinto com 70% de etanol, a fim de remover pistas olfativas indesejadas. Adicione uma pequena quantidade de roupa de cama da gaiola do animal na caixa de fuga para servir como uma sugestão olfativa. Antes de começar a tarefa, coloque cada rato na nova gaiola, e transfira a gaiola para a sala do labirinto barnes.
Para habituar, deixe o animal permanecer na sala por 30 minutos antes da tarefa. Em seguida, retire o rato de sua gaiola e coloque suavemente o animal na caixa de fuga, e deixe que ele permaneça lá por um minuto. Depois de um minuto, retire suavemente o rato da caixa de escape, coloque o animal no centro da arena e coloque a câmara de partida sobre ele.
Após um período de dez segundos, levante a câmara de largada e deixe o animal explorar a arena por três minutos. Mova-se silenciosamente para a área do computador, use earmuffs e desencadeie um estímulo auditivo negativo que consiste em um ruído branco alto. Em seguida, comece a filmar e observe o comportamento do animal no monitor do computador.
Note que um labirinto preto deve ser usado para testar ratos brancos. Além disso, um tapete preto deve ser colocado sob o labirinto no software do sistema de rastreamento de casos deve ser usado. Configure o programa de software de rastreamento de vídeo e extraia os parâmetros de interesse dos vídeos gravados.
Para uma avaliação bioquímica, disseque os tecidos do hipocampo, homogeneize-os em um tampão amostral, centrífuga-o e, em seguida, avalie seus níveis de ATP usando o método espectrofotométrico. A transmissão de luz laser de 660 nanômetros através do crânio mais couro cabeludo dos camundongos idosos foi de aproximadamente 16%Além disso, o valor de cerca de 10% foi medido como uma transmissão a laser através de uma fatia de um milímetro de tecido cerebral envelhecido. Não houve diferenças estatisticamente significativas no registro da atividade motora no teste de campo aberto entre todos os grupos experimentais.
Dados da tarefa do labirinto de Barnes mostraram que os tempos de latência dos animais de controle idosos são obviamente mais longos do que os do grupo de controle jovem no terceiro e quarto dias da sessão de treinamento. No entanto, o tratamento a laser vermelho reduziu significativamente o tempo de latência no quarto dia. Na sessão de ensaio prop, os animais de controle envelhecidos passam tempos significativamente mais curtos no quadrante alvo em comparação com os animais de controle jovens.
No entanto, os camundongos idosos tratados a laser passaram tempos significativamente mais longos nos quadrantes-alvo em comparação com os ratos de controle envelhecidos. Os dados de bioenergésticos hipocampais revelam uma diminuição nos níveis de ATP nos animais de controle envelhecidos. Por outro lado, o tratamento a laser vermelho aumenta significativamente o teor médio de ATP no hipocampo dos camundongos idosos.
Descrevemos o protocolo para a realização laboratorial de um procedimento de terapia fotobiomudulação transcranária em camundongos. Nosso protocolo pode ser adaptado a qualquer outro animal de laboratório que seja frequentemente usado no campo da neurociência translacional, como coelho, cão, macaco, etc. Com base em nossa investigação, baixos níveis de luz vermelha podem recuperar a disfunção hipocampal no cérebro envelhecido, aumentando a produção de ATP, o que se reflete em uma função de memória espacial aprimorada.
Neste método, baseado em quais regiões cerebrais são efetuadas pela patologia, vários parâmetros físicos e de tratamento, incluindo tempo de irradiação, intervalo de tratamento, brilho aplicado e fluência, são necessários para serem ajustados de forma ideal para alcançar melhores resultados. A terapia de fotobiomodulação transcranária é proposta como uma abordagem promissora para melhorar o metabolismo cerebral e o aprimoramento cognitivo que poderia ser uma estratégia potencial para o declínio cognitivo relacionado à idade e doenças neurodegenerativas.
