El objetivo general del siguiente protocolo experimental, es realizar una terapia de fotobiomodulación transcraneal utilizando bajos niveles de láser rojo en ratones. Esto se logra mediante el contacto directo de la sonda láser en la cabeza del ratón. Como primer paso, con el fin de evaluar la transmisión de la luz láser, disecciona cuidadosamente el tejido cerebral fuera del cráneo.
Y luego medir el poder de la luz transmitida a través del cráneo más el cuero cabelludo y una rebanada milimétrica del tejido cerebral. En la sección de terapia, póngase en contacto con la punta de la sonda láser directamente en el cuero cabelludo en el bregma. Esta tarea de laberinto de Barnes evalúa esta función de aprendizaje espacial y memoria.
Posteriormente, los niveles de ATP hipocampal se determinan mediante el método espectrofotométrico. Los datos de transmisión láser muestran que aproximadamente el 1% de la luz antecedente en la superficie del cuero cabelludo alcanzó un milímetro de profundidad desde la superficie cortical. Los resultados de la tarea de laberinto de Barnes muestran una mejora de la memoria espacial en los ratones envejecidos después de dos semanas del tratamiento con láser rojo transcraneal.
Además, los resultados sugieren un aumento de los niveles de ATP hipocampal en los ratones envejecidos tratados con láser. La fotobiomodulación transcraneal es un enfoque terapéutico no invasivo para el tratamiento de una amplia gama de trastornos neurológicos y psiquiátricos y para mejorar la función cerebral saludable. De hecho, se cree que la terapia de fotobiomodulación causa fotodisociación del óxido nítrico del citocromo c oxidasa en las mitocondrias.
Estos a su vez aumentan el transporte de electrones mitrocondriales, lo que en última instancia conduce a un aumento en la producción de ATP. Este método es un enfoque de suministro de luz seguro y rentable que se realiza mediante la radiación de la cabeza utilizando fuentes de luz externas, incluidos láseres y diodos emisores de luz. Casi todos los procedimientos de fotobiomodulación transcraneal se aplican con luz roja a casi infrarroja a una longitud de onda de 600 a 1100 nanómetros, una potencia que oscila entre uno y 500 milivatios, y la fluencia que va de uno a 20 julios por centímetro cuadrado.
En un ratón profundamente anestesiado, disecciona cuidadosamente el tejido cerebral fuera del cráneo. En primer lugar, fijar el tejido cerebral intacto en un gel de agarosa y preparar todos los materiales necesarios, incluyendo cloruro de sodio y pegamento. A continuación, extienda una fina capa de pegamento en la superficie del bloque de montaje del vibratomo.
Fije cuidadosamente el bloque de agarosa y ajuste su posición. Haga coincidir ligeramente la hoja vibratomo con la superficie superior del bloque y registre el valor del contador. Llene el tanque de vibratomo con solución salina normal helada.
Ajuste la velocidad y la frecuencia de vibración del vibratomo y cambie el contador al valor adecuado para obtener un grosor de rebanada de un milímetro. Encienda el vibratome y presione el botón de inicio y corte el cerebro transversalmente en una rebanada con un grosor de un milímetro. En primer lugar, agregue una gota de agua en la superficie de vidrio óptico.
Luego, pon la rebanada de cerebro en el vaso. Agregue la gota de agua y coloque cuidadosamente el segundo vidrio óptico. Tenga en cuenta que se debe añadir una gota de agua a los límites de la muestra y el vidrio con el fin de evitar el secado de tejido y también la dispersión de la luz de las superficies rugosas.
Transfiera muestras al laboratorio óptico. Configure los dispositivos ópticos y encienda el medidor de potencia. Use gafas de protección ocular antes de empezar a operar con el dispositivo láser.
Encienda el láser y haga que el haz se centre en el espejo para guiar el haz hacia el área activa del fotodiodo. En primer lugar, coloque dos gafas ópticas en blanco en la superficie del medidor de potencia y lea la potencia de luz transmitida desde la pantalla. Retire los anteojos en blanco y coloque suavemente la muestra del cerebro en la superficie del medidor de potencia, y enfoque el haz en el área respectiva del tejido, y lea la potencia transmitida.
Esta vez, coloque un vidrio óptico en blanco en la superficie del medidor de potencia y lea la potencia de luz transmitida. Luego, retire el vidrio en blanco y coloque ligeramente un vidrio óptico con cráneo fresco y tejido de cuero cabelludo en la superficie del medidor de potencia. Enfoque el haz en el bregma y lea la potencia transmitida.
Por último, apague el dispositivo láser y el medidor de potencia. La sección de terapia del protocolo actual incluye la aplicación de los instrumentos láser de clase 3B y esto requiere pautas de entrenamiento y seguridad adecuadas. Con el fin de adaptar los animales al nuevo entorno, llevar ratones de sus jaulas de origen a la sala de terapia aproximadamente 20 minutos antes de comenzar el tratamiento.
En primer lugar, inserte el enchufe del dispositivo láser en un protector eléctrico. Cubra la punta de la sonda láser con una película de nylon transparente para evitar cualquier rasguño en la superficie de la sonda. Conecte cuidadosamente la sonda láser al canal del dispositivo.
Use gafas de protección ocular antes de empezar a operar con el dispositivo láser. Encienda el dispositivo láser y espere unos segundos para su calentamiento. Después de observar el letrero Laser Ready en el panel del dispositivo, ajuste los parámetros de tratamiento, incluido el tiempo de irradiación y el modo de funcionamiento.
Antes de iniciar el tratamiento, determine la potencia media del láser poniéndose en contacto con la punta de la sonda con el área activa del medidor de potencia en el dispositivo. En el protocolo actual, la sonda láser se coloca en la zona del bregma, que es aproximadamente tres milímetros rostral a una línea dibujada entre la base anterior de las orejas. Con el fin de evitar la radiación directa a los ojos del animal, en primer lugar, coloque la punta de la sonda láser en la cabeza, luego, encienda el láser y sostenga la sonda de forma estable hasta la finalización de la irradiación.
A continuación, apague el dispositivo láser y desconecte la sonda del dispositivo. Al final del procedimiento, limpie la sonda láser con un limpiador óptico adecuado. La tarea de aprendizaje espacial y memoria se realiza en un laberinto de Barnes.
En primer lugar, coloque el signo no introducir en el exterior de la puerta de la sala de tareas. Adjunte señales espaciales visuales a los muros perimetrales. Coloque una cámara de vídeo sobre la plataforma del laberinto.
Limpie la superficie de la plataforma del laberinto con 70%etanol para eliminar las señales olfativas no deseadas. Agregue una pequeña cantidad de ropa de cama de la jaula de la casa del animal en la caja de escape para servir como una señal olfativa. Antes de comenzar la tarea, coloque cada ratón en la nueva jaula y transfiera la jaula a la sala de laberinto de Barnes.
Para habituar, deje que el animal permanezca en la habitación durante 30 minutos antes de la tarea. Luego, retire el ratón de su jaula y coloque suavemente el animal en la caja de escape, y deje que permanezca allí durante un minuto. Después de un minuto, retire suavemente el ratón de la caja de escape, coloque el animal en el centro de la arena y coloque la cámara de arranque en él.
Después de un período de diez segundos, levante la cámara de salida y permita que el animal explore la arena durante tres minutos. Muévete tranquilamente al área de la computadora, usa orejeras y activa un estímulo auditivo negativo que consiste en un ruido blanco fuerte. A continuación, comience a grabar en vídeo y observe el comportamiento del animal en el monitor de la computadora.
Tenga en cuenta que se debe utilizar un laberinto negro para probar ratones blancos. Además, se debe colocar una estera negra debajo del laberinto en el software del sistema de seguimiento de casos debe ser utilizado. Configure el programa de software de seguimiento de vídeo y extraiga los parámetros de interés de los vídeos grabados.
Para una evaluación bioquímica, diseccionar los tejidos del hipocampo, homogeneizarlos en un tampón de muestra, centrifugarlos y luego evaluar sus niveles de ATP utilizando el método espectrofotométrico. La transmisión de luz láser de 660 nanómetros a través del cráneo más el cuero cabelludo de los ratones envejecidos fue de aproximadamente 16%También, el valor de alrededor del 10% se midió como una transmisión láser a través de una rebanada de un milímetro de tejido cerebral envejecido. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el registro de la actividad motora en la prueba de campo abierto entre todos los grupos experimentales.
Los datos de la tarea del laberinto de Barnes mostraron que los tiempos de latencia de los animales de control envejecidos son obviamente más largos que los del grupo de control joven en el tercer y cuarto día de la sesión de entrenamiento. Sin embargo, el tratamiento con láser rojo redujo significativamente el tiempo de latencia en el cuarto día. En la sesión de prueba de apoyo, los animales de control envejecidos pasan tiempos significativamente más cortos en el cuadrante objetivo en comparación con los animales de control jóvenes.
Sin embargo, los ratones envejecidos tratados con láser pasaron tiempos significativamente más largos en los cuadrantes objetivo en comparación con los ratones de control envejecidos. Los datos de bioenergética del hipocampo revelan una disminución en los niveles de ATP en los animales de control envejecidos. Por otro lado, el tratamiento con láser rojo aumenta significativamente el contenido medio de ATP en el hipocampo de los ratones envejecidos.
Describimos el protocolo para la realización de laboratorios de un procedimiento de terapia de fotobiomudulación transcraneal en ratones. Nuestro protocolo se puede adaptar a cualquier otro animal de laboratorio que se utiliza con frecuencia en el campo de la neurociencia traslacional, como conejo, perro, mono, etc. Según nuestra investigación, los bajos niveles de luz roja pueden recuperar la disfunción del hipocampo en el cerebro envejecido al aumentar la producción de ATP, que se refleja en una función de memoria espacial mejorada.
En este método, en función de qué regiones cerebrales se realizan por patología, se requieren varios parámetros físicos y de tratamiento, incluyendo el tiempo de irradiación, el intervalo de tratamiento, la luminosidad aplicada y la fluidez, para ajustarse de manera óptima para lograr mejores resultados. La terapia de fotobiomodulación transcraneal se propone como un enfoque prometedor para mejorar el metabolismo cerebral y la mejora cognitiva que podría ser una estrategia potencial para el deterioro cognitivo relacionado con la edad y enfermedades neurodegenerativas.
