以下の実験プロトコルの全体的な目標は、マウスにおける低レベルの赤色レーザーを用いた経頭蓋光バイオ調節療法を行うことである。これは、マウスヘッド上のレーザープローブの直接接触によって達成される。第1のステップとして、レーザー光透過の評価を行うために、頭蓋から脳組織を慎重に解剖する。
そして、頭蓋骨と脳組織の頭皮と1ミリメートルのスライスを介して送信された光の電力を測定します。治療セクションでは、ブレグマの頭皮に直接レーザープローブの先端を連絡してください。この空間学習と記憶機能は、Barnes迷路タスクによって評価されます。
続いて、海馬ATPレベルは分光光度法によって決定される。レーザー伝送データは、頭皮表面の被写体光の約1%が皮質表面から1ミリメートルの深さに達したことを示しています。バーンズ迷路タスクの結果は、経頭蓋赤レーザー治療の2週間後に老化したマウスの空間記憶の改善を示す。
また、この結果は、レーザー処理された老化したマウスにおける海馬ATPレベルの増加を示唆している。経頭蓋光バイオモジュレーションは、神経疾患および精神疾患の広い範囲の治療と健康な脳機能の改善のための非侵襲的な治療アプローチです。実際、光生物調節療法は、ミトコンドリアのシトクロムcオキシダーゼからの一酸化窒素の光化を引き起こすと考えられている。
これらは、ひいては、結果的にATP生産の増加につながるミトクロコンドリア電子輸送を増加させる。この方法は、レーザーや発光ダイオードなどの外部光源を用いてヘッドの放射線によって行われる安全で費用対効果の高い光送りアプローチです。ほぼすべての経頭蓋光バイオ調節手順は、600〜1100ナノメートルの波長で赤から近赤外光、1〜500ミリワットの範囲の電力、および1〜20ジュール/センチメートル平方の範囲の蛍光で適用されます。
深く麻酔を受けたマウスでは、頭蓋骨から脳組織を慎重に解剖する。まず、アガロースゲルに無傷の脳組織を固定し、塩化ナトリウムおよび接着剤を含むすべての必要な材料を準備します。次に、ビブラートメ取り付けブロックの表面に接着剤の薄層を広げる。
慎重にアガロースブロックを取り付け、その位置を調整します。ブロックの上面にビブラートメブレードをわずかに一致させ、カウンタ値を記録します。バイブトメタンクに氷冷の通常の生理食酒水を充填します。
ビブラートの速度と振動周波数を調整し、1ミリメートルのスライス厚さを得るためにカウンターを適切な値に変更します。ビブラートメをオンにし、スタートボタンを押し、脳を1ミリメートルの厚さのスライスに切ります。まず、光学ガラス表面に水滴を加えます。
次に、ガラスの上に脳スライスを置きます。水滴を加え、2つ目の光学ガラスを慎重に設置します。なお、組織の乾燥や粗い表面からの光の散乱を防ぐために、サンプルとガラスの境界に水の滴を加える必要があります。
光学実験室にサンプルを移す。光デバイスをセットアップし、電源メーターをオンにします。レーザー装置で操作を開始する前に、目の保護ゴーグルを着用してください。
レーザーをオンにし、光線をミラーに焦点を当て、光線をフォトダイオードのアクティブエリアに導きます。まず、電源計の表面に空の光学メガネを2枚置き、表示画面から透過光の電力を読み取る。空の眼鏡を取り外し、脳サンプルをパワーメーターの表面にそっと置き、ビームを組織のそれぞれの領域に集中させ、送信された電力を読み取ります。
今回は、パワーメータの表面に空の光学ガラスを置き、透過光パワーを読み取ります。次に、空のガラスを取り外し、パワーメーターの表面に新鮮な頭蓋骨と頭皮組織を持つ光学ガラスをわずかに置きます。ビームをブレグマに焦点を当て、送信された電力を読み取ります。
最後に、レーザーデバイスとパワーメーターの電源を切ります。現在のプロトコルの療法セクションはクラス3Bレーザーの器械の適用を含んでいる、これは適切な訓練および安全の指針を要求する。動物を新しい環境に適応させるために、マウスを自宅のケージから治療室に持ち込み、治療を開始する約20分前に行ってください。
まず、レーザーデバイスのプラグを電気プロテクターに差し込みます。レーザープローブの先端を透明なナイロンフィルムで覆い、プローブ表面に引っ掻き込むのを防ぎます。レーザープローブをデバイスのチャネルに慎重に接続します。
レーザー装置で操作を開始する前に、目の保護ゴーグルを着用してください。レーザーデバイスの電源を入れ、ウォームアップを数秒待ちます。デバイスパネルのレーザー作動サインを観察した後、照射時間と動作モードを含む処理パラメータを調整します。
処理を開始する前に、プローブの先端をデバイス上のパワーメーターのアクティブ領域に接触させることにより、レーザー平均電力を測定します。現在のプロトコルでは、レーザープローブはブレグマゾーンに配置され、これは耳の前部の間に引かれた線に約3ミリメートルのロストラルです。動物の目への直接放射を避けるために、まず、レーザープローブの先端を頭部に置き、次にレーザーをオンにし、照射が完了するまでプローブを安定して保持する。
次に、レーザーデバイスの電源を切り、プローブをデバイスから取り外します。手順の最後に、適切な光学クリーナーでレーザープローブをクリーニングします。空間学習と記憶タスクは、バーンズの迷路で実行されます。
まず、タスクルームのドアの外側にサインを入力しないでください。周囲の壁に視覚的な空間的なキューをアタッチします。迷路プラットフォームの上にビデオカメラを配置します。
不要な嗅覚の手がかりを除去するために、70%エタノールで迷路プラットフォームの表面をきれいにします。動物の自宅のケージから少量の寝具をエスケープボックスに追加して、嗅覚の手がかりとして機能します。タスクを開始する前に、新しいケージに各マウスを入れて、バーンズ迷路の部屋にケージを転送します。
習慣化するには、動物がタスクの前に30分間部屋に残ることを許可します。その後、ケージからマウスを取り出し、動物を脱出ボックスにそっと置き、1分間そこに残します。1分後、脱出ボックスからマウスをそっと取り出し、動物をアリーナの中央に置き、その上にスタートチャンバーを置きます。
10秒の期間の後、スタートチャンバーを持ち上げ、動物が3分間アリーナを探索できるようにします。静かにコンピュータエリアに移動し、イヤーマフを着用し、大きなホワイトノイズからなる負の聴覚刺激を引き起こします。次に、ビデオ撮影を開始し、コンピュータモニタで動物の行動を観察します。
白いマウスのテストには黒い迷路を使用する必要があります。また、ブラックマットは、ケース追跡システムソフトウェアが使用される場合の迷路の下に配置する必要があります。ビデオトラッキングソフトウェアプログラムを設定し、録画したビデオから目的のパラメータを抽出します。
生化学的評価のために、海馬組織を解剖し、サンプルバッファーで均質化し、遠心分離し、分光光法を用いてATPレベルを評価する。660ナノメートルのレーザー光透過は、加齢マウスの頭蓋骨と頭皮を透過し、また、約10%の値を、老化した脳組織の1ミリメートルスライスを通してレーザー透過率として測定した。全ての実験群の間で、オープンフィールド試験における運動活動の対数に統計的に有意な差はなかった。
Barnes迷路タスクからのデータは、老化したコントロール動物の待ち時間がトレーニングセッションの3日目と4日目の若い対照群の待ち時間よりも明らかに長いことを示しました。しかし、赤レーザー治療は4日目の待ち時間を大幅に短縮しました。プロップトライアルセッションでは、老朽化したコントロール動物は、若い対照動物と比較して、標的象限で有意に短い時間を過ごす。
しかし、レーザー処理された老化したマウスは、老化した対照マウスと比較して、標的象限で有意に長い時間を費やした。海馬のバイオエネルギーデータは、老齢制御動物のATPレベルの低下を明らかにする。一方、赤レーザー治療は、老化したマウスの海馬における平均ATP内容物を有意に増加させる。
我々は、マウスにおける経頭蓋光ビオムテーション療法手順を実施する実験室のためのプロトコルを説明した。当社のプロトコルは、ウサギ、犬、サル、エトセトラなどの翻訳神経科学分野で頻繁に使用される他の実験動物に適応することができます。我々の調査に基づいて、低レベルの赤い光は、強化された空間記憶機能に反映されるATP産生を高めることによって、老化した脳の海馬機能不全を回復することができる。
この方法では、どの脳領域が病理によって影響を受けるかに基づいて、照射時間、治療間隔、照射輝度、およびフルエンスを含むいくつかの物理的および治療パラメータは、より良い結果を達成するために最適に調整されることが必要である。経頭蓋光調節療法は、加齢に伴う認知機能低下や神経変性疾患の潜在的な戦略となり得る脳代謝と認知機能の向上を改善するための有望なアプローチとして提案されている。
