다음 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 쥐에서 낮은 수준의 적색 레이저를 사용하여 경두개 광생물 변조 요법을 수행하는 것이다. 이것은 마우스 머리에 레이저 프로브의 직접 접촉에 의해 수행된다. 첫 번째 단계로, 레이저 광 전달의 평가하기 위해, 신중하게 두개골에서 뇌 조직을 해부.
그런 다음 두개골과 두피 와 뇌 조직의 1 밀리미터 조각을 통해 전달 된 빛의 힘을 측정합니다. 치료 섹션에서, bregma에서 두피에 직접 레이저 프로브의 끝을 문의. 이 공간 학습 및 메모리 기능은 반즈 미로 작업에 의해 평가됩니다.
이어서, 해마 ATP 수준은 분광측정 방법에 의해 결정된다. 레이저 전송 데이터는 두피 표면의 선행 광의 약 1 %가 피질 표면에서 1 밀리미터 깊이에 도달한 것으로 나타났습니다. 반즈 미로 작업의 결과는 경두개 붉은 레이저 치료의 2 주 다음 노인 마우스에서 공간 메모리의 개선을 보여줍니다.
또한, 결과 레이저 치료 숙성 쥐에서 증가 해 마 ATP 수준을 제안. 경두개 광생물변조는 광범위한 신경 및 정신 질환의 치료와 건강한 뇌 기능을 개선하기 위한 비침습적 치료 접근법입니다. 실제로, 광생물 변조 요법은 미토콘드리아의 시토크롬 c 산화제에서 산화 질소의 광합성을 유발한다고 믿습니다.
이들은 차례차례로 ATP 생산에 있는 증가로 이끌어 내는 mitrochondrial 전자 수송을 증가합니다. 이 방법은 레이저 및 발광 다이오드를 포함한 외부 광원을 사용하여 헤드의 방사선에 의해 수행되는 안전하고 비용 효율적인 광 전달 접근법입니다. 거의 모든 경두개 광생물 변조 절차는 600에서 1100 나노미터, 1에서 500 밀리와트에 이르는 전력, 1에서 20 주얼 미터 평방 에 이르는 연도에 가까운 적외선에 빨간색으로 적용됩니다.
깊은 마취 마우스에서, 조심스럽게 두개골에서 뇌 조직을 해부. 먼저, 아가로즈 젤에 손상되지 않은 뇌 조직을 고정하고 염화나트륨과 접착제를 포함한 필요한 모든 물질을 준비한다. 그런 다음, 진동 마운팅 블록의 표면에 접착제의 얇은 층을 확산.
조심스럽게 아가로즈 블록을 부착하고 위치를 조정합니다. 진동 블레이드를 블록의 상부 표면과 약간 일치시키고 카운터 값을 기록합니다. 진동 탱크를 얼음처럼 차가운 일반 식염수 용액으로 채웁니다.
진동의 속도와 진동 주파수를 조정하고 카운터를 1mm의 슬라이스 두께를 얻기위한 적절한 값으로 변경합니다. 진동을 켜고 시작 버튼을 누르고 1 밀리미터두께의 슬라이스로 뇌를 반경으로 자른다. 먼저 광학 유리 표면에 물 한 방울을 추가합니다.
그런 다음, 유리에 뇌 조각을 넣어. 물 방울을 넣고 두 번째 광학 유리를 조심스럽게 놓습니다. 조직 건조를 방지하고 거친 표면에서 빛이 산란되는 것을 방지하기 위해 물 한 방울을 샘플 및 유리 경계에 추가해야합니다.
샘플을 광학 실험실로 옮기. 광학 장치를 설정하고 전원 미터를 켭니다. 레이저 장치로 작동하기 전에 눈 보호 고글을 착용하십시오.
레이저를 켜고 광선이 거울에 초점을 맞추어 광선을 포토디오드의 활성 영역으로 안내하도록 합니다. 먼저, 파워 미터의 표면에 두 개의 빈 광학 안경을 배치하고 디스플레이 화면에서 전송 된 광 전력을 읽습니다. 빈 안경을 제거하고 뇌 샘플을 파워 미터 표면에 부드럽게 배치하고 조직의 각 영역에 빔을 집중하고 전달 된 힘을 읽습니다.
이번에는 파워 미터의 표면에 빈 광학 유리를 놓고 송신 된 광 전력을 읽습니다. 그런 다음 빈 유리를 제거하고 전원 미터 표면에 신선한 두개골과 두피 조직으로 광학 유리를 약간 놓습니다. 브레그마에 빔을 집중하고 전달된 전력을 읽습니다.
마지막으로 레이저 장치와 파워 미터를 끕니다. 현재 프로토콜의 치료 섹션에는 클래스 3B 레이저 계측기의 적용이 포함되며 적절한 교육 및 안전 지침이 필요합니다. 새로운 환경에 동물을 적응시키기 위하여는, 치료를 시작하기 약 20 분 전에 그들의 홈 케이지에서 치료실에 마우스를 가지고.
먼저 레이저 장치 플러그를 전기 보호기에 삽입합니다. 프로브 표면에 긁히지 않도록 투명 나일론 필름으로 레이저 프로브의 끝을 덮습니다. 레이저 프로브를 장치의 채널에 조심스럽게 연결합니다.
레이저 장치로 작동하기 전에 눈 보호 고글을 착용하십시오. 레이저 장치를 켜고 워밍업을 위해 몇 초 동안 기다립니다. 장치 패널에서 레이저 준비 기호를 관찰한 후 조사 시간 및 작동 모드를 포함한 치료 매개 변수를 조정합니다.
치료를 시작하기 전에, 프로브의 끝을 장치의 파워 미터의 활성 영역에 접촉하여 레이저 평균 전력을 결정한다. 현재 프로토콜에서 레이저 프로브는 브레그마 영역에 배치되며, 이는 귀의 전방 베이스 사이에 그려진 선에 약 3밀리미터 로스트럴이 있습니다. 동물의 눈에 직접 방사선을 피하기 위해 먼저 레이저 프로브의 끝을 머리에 놓고 레이저 프로브를 켜고 조사가 완료 될 때까지 프로브를 안정적으로 유지하십시오.
그런 다음 레이저 장치를 끄고 장치에서 프로브를 분리합니다. 절차가 끝나면 적절한 광학 클리너로 레이저 프로브를 청소하십시오. 공간 학습 및 메모리 작업은 반즈 미로에서 수행됩니다.
먼저 작업실 문 바깥쪽에 표지판을 입력하지 마십시오. 주변 벽에 시각적 공간 신호를 연결합니다. 미로 플랫폼 위에 비디오 카메라를 배치합니다.
원치 않는 후각 큐를 제거하기 위해 70 %에탄올로 미로 플랫폼의 표면을 청소하십시오. 동물의 집 새장에서 소량의 침구를 이스케이프 박스에 추가하여 후각 신호역할을 합니다. 작업을 시작하기 전에 각 마우스를 새 케이지에 넣고 케이지를 반즈 미로 룸으로 옮습니다.
습관화하려면 동물이 작업 전에 30 분 동안 방에 남아 있게하십시오. 그런 다음 케이지에서 마우스를 제거하고 동물을 이스케이프 박스에 부드럽게 넣고 1 분 동안 거기에 남아 있게하십시오. 1 분 후, 부드럽게 탈출 상자에서 마우스를 제거하고, 경기장의 중앙에 동물을 배치하고, 그것에 시작 챔버를 넣어.
10초 후, 시작 챔버를 들어 올려 동물이 3 분 동안 경기장을 탐험 할 수 있습니다. 조용히 컴퓨터 영역으로 이동하고 귀덮개를 착용하고 큰 백색 잡음으로 구성된 부정적인 청각 자극을 유발합니다. 그런 다음 비디오 녹화를 시작하고 컴퓨터 모니터에서 동물의 행동을 관찰합니다.
검은 미로는 흰색 마우스를 테스트하는 데 사용되어야한다. 또한, 블랙 매트는 케이스 추적 시스템 소프트웨어가 사용되는 경우미제 아래에 배치되어야한다. 비디오 추적 소프트웨어 프로그램을 설정하고 녹화된 비디오에서 관심 있는 매개 변수를 추출합니다.
생화학적 평가를 위해 해마 조직을 해부하고, 샘플 버퍼에서 균질화하고, 원심분리한 다음, 분광측정 방법을 사용하여 ATP 수준을 평가합니다. 660 나노미터 레이저 광 전달은 두개골과 숙성마우스의 두피를 통한 약 16%였으며, 약 10%의 가치는 숙성된 뇌 조직의 1밀리미터 슬라이스를 통해 레이저 투과로 측정하였다. 모든 실험 군 중 열린 필드 테스트에서 모터 활동의 로그에 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
반즈 미로 작업의 데이터는 노인 대조군의 대기 시간이 훈련 세션의 세 번째와 네 번째 날에 젊은 대조군의 대기 시간이 분명히 더 길다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 적색 레이저 치료는 4일째에 대기 시간을 현저히 감소시키는 것으로. 소품 시험 세션에서, 노인 제어 동물은 젊은 제어 동물에 비해 대상 사분면에서 상당히 짧은 시간을 보낸다.
그러나, 레이저 처리된 숙성된 마우스는 노인 대조군 마우스에 비해 표적 사분면에서 상당히 더 긴 시간을 보냈다. 해마 생물 에너지 데이터는 노인 대조군 동물의 ATP 수준 감소를 보여줍니다. 한편, 적색 레이저 치료는 숙성된 마우스의 해마내평균 ATP 함량을 현저히 증가시킨다.
우리는 마우스에서 경두개 광생물 무드 치료 절차를 수행하는 실험실에 대한 프로토콜을 설명했다. 우리의 프로토콜은 토끼, 개, 원숭이, 등 세테라와 같은 번역 신경 과학 분야에서 자주 사용되는 다른 실험실 동물에 적응 할 수 있습니다. 우리의 조사에 따라, 적색광의 낮은 수준은 향상된 공간 기억 기능에 반영되는 ATP 생산을 증폭하여 노인 두뇌에 있는 해마 분해를 복구할 수 있습니다.
이 방법에서는 병리학에 의해 어떤 뇌 영역이 영향을 받는지에 따라 조사 시간, 치료 간격, 적용 된 광채 및 연도를 포함한 여러 신체 및 치료 매개 변수가 더 나은 결과를 달성하기 위해 최적으로 조정되어야합니다. 경두개 광생물 변조 치료는 노화와 관련된 인지 기능 저하 및 신경 퇴행성 질환에 대한 잠재적 인 전략이 될 수있는 뇌 대사 와 인지 향상을 개선하기위한 유망한 접근 법으로 제안됩니다.
