L’objectif global du protocole expérimental suivant, est d’effectuer une thérapie transcrânienne de photobiomodulation utilisant de faibles niveaux de laser rouge chez la souris. Ceci est accompli par le contact direct de la sonde laser sur la tête de la souris. Dans un premier temps, afin d’évaluer la transmission de la lumière laser, disséquer soigneusement le tissu cérébral du crâne.
Et puis mesurer la puissance de la lumière transmise à travers le crâne plus le cuir chevelu et une tranche millimétrique du tissu cérébral. Dans la section thérapie, contactez la pointe de la sonde laser directement sur le cuir chevelu au bregma. Cette tâche d’apprentissage spatial et de mémoire est évaluée par barnes tâche labyrinthe.
Par la suite, les niveaux hippocampal d’ATP sont déterminés par la méthode spectrophotométrique. Les données de transmission au laser montrent qu’environ 1% de la lumière antécédente sur la surface du cuir chevelu a atteint une profondeur millimétrique de la surface corticale. Les résultats de la tâche de labyrinthe de Barnes montrent une amélioration de la mémoire spatiale chez les souris âgées après deux semaines du traitement transcrânienne au laser rouge.
En outre, les résultats suggèrent une augmentation des niveaux d’ATP hippocampal chez les souris âgées traitées au laser. La photobiomodulation transcrânienne est une approche thérapeutique non invasive pour le traitement d’un large éventail de troubles neurologiques et psychiatriques et pour améliorer la fonction cérébrale saine. En effet, on croit que la thérapie de photobiomodulation provoque la photodissociation de l’oxyde nitrique de la cytochrome c oxidase dans les mitochondries.
Ceux-ci augmentent à leur tour le transport d’électrons mitrochondrial, ce qui conduit finalement à une augmentation de la production d’ATP. Cette méthode est une approche sûre et rentable de livraison de la lumière qui est effectuée par rayonnement de la tête en utilisant des sources de lumière externes, y compris les lasers et les diodes électroluminescentes. Presque toutes les procédures de photobiomodulation transcrânienne sont appliquées avec de la lumière rouge à la lumière proche infrarouge à longueur d’onde de 600 à 1100 nanomètres, une puissance allant de 1 à 500 milliwatt, et la fluence allant de un à 20 joule par centimètre carré.
Dans une souris profondément anesthésiée, disséquez soigneusement le tissu cérébral du crâne. Tout d’abord, fixer le tissu cérébral intact sur un gel agarose et préparer tous les matériaux nécessaires, y compris le chlorure de sodium et de la colle. Ensuite, étalez une fine couche de colle à la surface du bloc de montage vibratome.
Fixez soigneusement le bloc agarose et ajustez sa position. Faire correspondre légèrement la lame vibratoire à la surface supérieure du bloc et enregistrer la valeur du compteur. Remplissez le réservoir vibratome d’une solution saline normale glacée.
Ajustez la vitesse et la fréquence des vibrations du vibratome et changez le compteur en valeur appropriée pour obtenir une épaisseur de tranche d’un millimètre. Allumez le vibratome et appuyez sur le bouton de démarrage et coupez le cerveau transversalement en une tranche d’une épaisseur d’un millimètre. Tout d’abord, ajouter une goutte d’eau sur la surface de verre optique.
Ensuite, mettez la tranche de cerveau sur le verre. Ajouter la goutte d’eau sur elle, et placer soigneusement le deuxième verre optique. Notez qu’une goutte d’eau doit être ajoutée aux limites de l’échantillon et du verre afin d’éviter le séchage des tissus et aussi la diffusion légère des surfaces rugueuses.
Transférer des échantillons au laboratoire optique. Configurez les appareils optiques et allumez le compteur d’alimentation. Portez des lunettes de protection oculaire avant de commencer à fonctionner avec le dispositif laser.
Allumez le laser et concentrez le faisceau sur le miroir pour guider le faisceau vers la zone active du photodiode. Tout d’abord, placez deux verres optiques vierges à la surface du compteur de puissance et lisez la puissance lumineuse transmise à partir de l’écran d’affichage. Retirez les verres blancs et placez doucement l’échantillon de cerveau à la surface du compteur de puissance, et concentrez le faisceau sur la zone respective du tissu, et lisez la puissance transmise.
Cette fois,, placez un verre optique vierge sur la surface du compteur de puissance et lire la puissance de la lumière transmise. Ensuite, retirez le verre blanc et placez légèrement un verre optique avec le crâne frais et le tissu scalpé sur la surface du compteur de puissance. Concentrez le faisceau sur le bregma et lisez la puissance transmise.
Enfin, éteignez le dispositif laser et le compteur de puissance. La section thérapie du protocole actuel comprend l’application des instruments laser de classe 3B, ce qui nécessite une formation adéquate et des lignes directrices en matière de sécurité. Afin d’adapter les animaux au nouvel environnement, amener les souris de leurs cages à la maison à la salle de thérapie environ 20 minutes avant le début du traitement.
Tout d’abord, insérez le bouchon du dispositif laser dans un protecteur électrique. Couvrez la pointe de la sonde laser d’un film en nylon transparent afin d’éviter toute égratignure à la surface de la sonde. Connectez soigneusement la sonde laser au canal de l’appareil.
Portez des lunettes de protection oculaire avant de commencer à fonctionner avec le dispositif laser. Allumez le dispositif laser et attendez quelques secondes pour son échauffement. Après avoir observé le panneau Laser Ready sur le panneau de l’appareil, ajustez les paramètres de traitement, y compris le temps d’irradiation et le mode de fonctionnement.
Avant de commencer le traitement, déterminez la puissance moyenne du laser en contactant la pointe de la sonde à la zone active du compteur de puissance sur l’appareil. Dans le protocole actuel, la sonde laser est placée sur la zone de bregma, qui est d’environ trois millimètres rostral à une ligne tracée entre la base antérieure des oreilles. Afin d’éviter les radiations directes aux yeux de l’animal, placez d’abord la pointe de la sonde laser sur la tête, puis allumez le laser et maintenez la sonde de façon habile jusqu’à l’achèvement de l’irradiation.
Ensuite, éteignez le dispositif laser et déconnectez la sonde de l’appareil. À la fin de la procédure, nettoyez la sonde laser avec un nettoyant optique approprié. La tâche d’apprentissage spatial et de mémoire est effectuée dans un labyrinthe Barnes.
Tout d’abord, placez le panneau ne pas entrer à l’extérieur de la porte de la salle de travail. Fixez des repères spatiaux visuels aux parois périphériques. Placez une caméra vidéo au-dessus de la plate-forme de labyrinthe.
Nettoyez la surface de la plate-forme de labyrinthe avec 70% d’éthanol afin d’éliminer les indices olfactifs indésirables. Ajoutez une petite quantité de literie de la cage de l’animal dans la boîte d’évacuation pour servir de signal olfactif. Avant de commencer la tâche, mettez chaque souris dans la nouvelle cage, et transférez la cage dans la salle de labyrinthe Barnes.
Pour s’habituer, laissez l’animal rester dans la pièce pendant 30 minutes avant la tâche. Ensuite, retirez la souris de sa cage et placez doucement l’animal dans la boîte d’évacuation, et laissez-la y rester pendant une minute. Après une minute, retirez doucement la souris de la boîte d’évacuation, placez l’animal au centre de l’arène et mettez la chambre de départ dessus.
Après une période de dix secondes, soulevez la chambre de départ et laissez l’animal explorer l’arène pendant trois minutes. Déplacez-vous tranquillement vers la zone de l’ordinateur, portez des cache-oreilles et déclenchez un stimulus auditif négatif composé d’un bruit blanc fort. Ensuite, commencez à filmer et observez le comportement de l’animal sur le moniteur d’ordinateur.
Notez qu’un labyrinthe noir doit être utilisé pour tester les souris blanches. En outre, un tapis noir doit être placé sous le labyrinthe dans le logiciel de système de suivi de cas doit être utilisé. Configurer le logiciel de suivi vidéo et extraire les paramètres d’intérêt des vidéos enregistrées.
Pour une évaluation biochimique, disséquer les tissus de l’hippocampe, les homogénéiser dans un tampon d’échantillon, le centrifuger, puis évaluer ses niveaux d’ATP à l’aide de la méthode spectrophotométrique. La transmission de lumière laser de 660 nanomètres à travers le crâne plus le cuir chevelu des souris âgées était d’environ 16%En outre, la valeur d’environ 10% a été mesurée comme une transmission laser à travers une tranche d’un millimètre de tissu cérébral âgé. Il n’y avait aucune différence statistiquement significative dans le journal de l’activité motrice dans l’essai en plein champ entre tous les groupes expérimentaux.
Les données de barnes maze tâche a montré que les temps de latence des animaux de contrôle âgés sont évidemment plus longs que ceux du jeune groupe témoin sur les troisième et quatrième jours de la session d’entraînement. Cependant, le traitement au laser rouge a considérablement réduit le temps de latence le quatrième jour. Au cours de la séance d’essai d’accessoires, les animaux de contrôle âgés passent beaucoup moins de temps dans le quadrant cible que les jeunes animaux de contrôle.
Cependant, les souris âgées traitées au laser ont passé beaucoup plus de temps dans les quadrants cibles par rapport aux souris témoins âgées. Les données bioénergétiques hippocampiques révèlent une diminution des niveaux d’ATP chez les animaux de contrôle âgés. D’autre part, le traitement au laser rouge augmente considérablement le contenu moyen de l’ATP dans l’hippocampe des souris âgées.
Nous avons décrit le protocole pour le laboratoire effectuant une procédure transcranial de thérapie de photobiomudulation chez les souris. Notre protocole peut être adapté à tous les autres animaux de laboratoire qui sont fréquemment utilisés dans le domaine des neurosciences translationnelles, comme le lapin, le chien, le singe, et cetera. Basé sur notre étude, de faibles niveaux de lumière rouge peuvent récupérer la disfonction hippocampale dans le cerveau âgé en stimulant la production d’ATP, qui se reflète dans une fonction améliorée de mémoire spatiale.
Dans cette méthode, basée sur les régions du cerveau qui sont touchées par la pathologie, plusieurs paramètres physiques et de traitement, y compris le temps d’irradiation, l’intervalle de traitement, l’éclat appliqué et la fluence, doivent être ajustés de manière optimale pour obtenir de meilleurs résultats. La thérapie transcrânienne de photobiomodulation est proposée comme approche prometteuse pour améliorer le métabolisme de cerveau et l’amélioration cognitive qui pourraient être une stratégie potentielle pour le déclin cognitif lié à l’âge et les maladies neurodégénératives.
