تسلط هذه التجربة الضوء على القيمة العلاجية للأجسام المضادة المضادة لمضادات الـ C-fms في أمراض اضطراب العظام الالتهابي، مثل التهاب المفاصل الروماتويدي والتهاب اللثة. العملية التي يتم من خلالها استخراج نخاع العظم واستخدامها لتوليد السلائف العظمية ، تسفر عن كميات كبيرة من العظام النقية ، والتي يمكن استخدامها في تطبيقات متعددة المصب. يوفر هذا البروتوكول طريقتين بديلتين لنشأة العظام، إما باستخدام رانكل ليجند أو TNF ألفا.
بالإضافة إلى ذلك، يوفر هذا الأسلوب نظرة ثاقبة تأثير الأجسام المضادة المضادة-c-fms على تكوين العظام. عرض مرئي لهذا الإجراء يطلع الباحث على عملية تشريح و الحصول على خلايا نخاع العظام بكميات كبيرة. لبدء ملء لوحة من شأنها أن تكون بمثابة حاوية جمع مع ما يقرب من 50 ملليلتر من ألفا MEM، اعتمادا على حجم الحاوية، ووضعها على الجليد.
استخدام دبابيس لاختراق من خلال النخيل والقدمين من الماوس القتل الرحيم لإصلاحه في موقف supine، ورذاذ جيدا مع الإيثانول 70٪. استخدم مقصًا جراحيًا معقمة وملاقطًا لإجراء شق جلدي على مستوى الورك وتمديده إلى القدمين ، مما يعرض العضلات. تحديد موقع وقطع وتر ربط العضلات رباعية.
قشر العضلات بعيدا وقطع على مستوى الورك. ثم حدد مكان وتر ربط عضلة أوتار الركبة إلى العظام. قشر بعيدا العضلات تعريض العظام، وتحرير اوتار الركبة من تعلقها، والتأكد من عدم قطع في العظام.
ضع المقص بين رأس عظم الفخذ ومساحة المفصل. قطع في ذلك تحرير عظم الفخذ، ولكن الحفاظ على العظام سليمة، والتي سوف تمكن مفرزة من العظام دون خطر التعرض لنخاع العظام. قطع العضلات تعلق على الساق بطريقة مماثلة.
ثم قطع الساق خالية من تعلقها في مفصل الكاحل، مع الحفاظ على العظام سليمة لتجنب التلوث. استخدام شفرات مقص ومناديل مختبر لكشط أي الأنسجة الرخوة المتبقية من عظم الفخذ والساق ووضعها في لوحة معدة مع ألفا MEM وضعت على الجليد. وينبغي أن يتم تشريح بعناية للحد من التلوث.
هذا هو السبب في إزالة الأنسجة الرخوة الشاملة وتوطين العظام حاسمة. املأ حقنة إبرة قياس 30 مع ألفا ميوم. افصل الساق وعظم الفخذ بعيدًا عن مفصل الركبة ، وقطع نهايات العظم الطويل من كلا الجانبين باستخدام المقص.
استخدام ملاقط لعقد العظام من رمح. أدخل الإبرة في مساحة النخاع إلى العظم واغسل محتوى النخاع ببطء في طبق ثقافة ستة سنتيمترات وكرره لجميع العظام. سوف تتحول إلى اللون الأبيض العظام، مما يدل على استخراج جميع محتوى نخاع العظام.
استخدام 40 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون للضغط على استخراج نخاع العظم في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل المُندفع.
لغسل، إضافة خمسة ملليلتر من ألفا MEM إلى بيليه. Pipette الخلايا لفصل لهم، الطرد المركزي، وتكرار غسل ما مجموعه مرتين. بعد عد هذه الخلايا المعزولة، كما هو موضح في المخطوطة، بذور 10 ملايين خلية لكل 10 ملليلترات، في طبق ثقافة 10 سنتيمترات، وإضافة M-CSF إلى الخلايا.
احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. إزالة المتوسطة بعد ثلاثة أيام، وغسل الخلايا مرتين بقوة مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا غير المُخلّصة. إضافة خمسة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة 0.02٪ التربسين-EDTA وBBS، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق.
دقيق بدقة الخلايا لفصل لهم. مراقبة الثقافة تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد تم فصلها وتظهر مدورة وطفوة في وسائل الإعلام. عندما يتم فصل الخلايا، إلغاء تنشيط التفاعل عن طريق إضافة خمسة ملليلترات من MEM ألفا.
جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر والطرد المركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المابير، اغسل بخمسة ملليلترات من ألفا ميوم، والطرد المركزي مرة أخرى عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من ألفا MEM.
بذور 1 مليون خلية لكل 10 ملليلتر في طبق ثقافة 10 سنتيمترا، وإضافة M-CSF. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. حصاد الخلايا المرفقة، والتي تمثل BMMs السلائف العظمية بعد ثلاثة أيام، كما فعلت سابقا خلال توليد من BMMs.
بذور BMMs في 50، 000 خلية لكل 200 لتر ميكرو من ألفا MEM في لوحة 96 جيدا في بئر. إلى كل بئر، إضافة المحفزات المطلوبة. ثم يضاف M-CSF لتركيز نهائي من 100 نانوغرام لكل ملليلتر.
إضافة المضادة-c-fms الأجسام المضادة لكل بئر. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربعة أيام، في حين تغيير وسائل الإعلام كل يومين لمدة أربعة أيام. ثم المضي قدما في تلطيخ والملايس، كما هو موضح في المخطوطة.
تم تقييم تكوين العظام في M-CSF وCL الثقافة المعالجة، مع الأجسام المضادة C-fms. مع 101،000 نانوغرام لكل ملليلتر المضادة لC-FMS الأجسام المضادة، لوحظ انخفاض كبير في عدد من العظام مقارنة مع التحكم. وحيث أنه، مع واحد من كل 10 نانوغرام لكل ملليلتر مضاد C-fms، لم يكن هناك انخفاض كبير.
ثم، تم تقييم تشكيل العظام في M-CSF و TNF ألفا الثقافة المعالجة، مع المضادة-c-fms الأجسام المضادة. مع 10، 100، 1،000 نانوغرام لكل ملليلتر المضادة ل-c-fms، لوحظ انخفاض كبير في عدد من العظام مقارنة مع السيطرة، مع عدم وجود انخفاض كبير في نانوغرام واحد لكل ملليلتر. وثقافة M-CSF مع 1, 10, 100 نانوغرام لكل ملليلتر المضادة للجسم المضاد C-fms, لم يكن هناك انخفاض كبير في عدد السلائف العظمية مقارنة مع السيطرة.
ومع ذلك، عند 000 1 نانوغرام لكل ملليلتر، كان هناك انخفاض كبير في عدد السلائف العظمية، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى تركيز يصل إلى 000 1 نانوغرام لكل ملليلتر لمنع انتشار السلائف العظمية بشكل كبير. تأكد من تحرير السندات مع الحفاظ على العظام سليمة، والتي سوف تقلل من فرصة للتلوث.
