Questo esperimento evidenzia il valore terapeutico dell'anticorpo Anti-c-fms nelle malattie di disturbo infiammatorio osseo, come l'artrite reumatoide e la parodontite. Il processo con cui il midollo osseo viene estratto e utilizzato per generare precursori di osteoclasti, produce grandi quantità di osteoclasti puri, che possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle. Questo protocollo fornisce due metodi alternativi di osteoclastogenesi, utilizzando ligando RANKL o TNF alpha.
Inoltre, questo metodo fornisce informazioni sull'effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sull'osteoclastogenesi. La dimostrazione visiva di questa procedura familiarizza il ricercatore con il processo di dissezione e l'ottenimento di cellule del midollo osseo in grandi quantità. Per iniziare riempire un piatto che fungerà da contenitore di raccolta con circa 50 millilitri di MEM alfa, a seconda delle dimensioni del contenitore, e posizionarlo sul ghiaccio.
Utilizzare perni per perforare i palmi e i piedi di un topo eutanasiato per fissarlo in posizione supina e spruzzare accuratamente con il 70% di etanolo. Usa forbici chirurgiche sterili e pinzette per fare un'incisione cutanea a livello dell'anca ed estenderla fino ai piedi, esponendo i muscoli. Individuare e tagliare il tendine attaccando il muscolo quadricipite.
Stacca il muscolo e taglialo a livello dell'anca. Quindi individuare il tendine che attacca il muscolo del tendine del ginocchio all'osso. Staccare i muscoli esponendo l'osso e liberare il tendine del ginocchio dal suo attaccamento, assicurandosi di non tagliarlo all'osso.
Posizionare le forbici tra la testa del femore e lo spazio articolare. Tagliarlo liberando il femore, ma mantenendo intatto l'osso, il che consentirà il distacco delle ossa senza il rischio di esporre il midollo osseo. Tagliare i muscoli attaccati alla tibia in modo simile.
Quindi tagliare la tibia libera dal suo attacco all'articolazione della caviglia, mantenendo intatto l'osso per evitare contaminazioni. Utilizzare le lame a forbice e le salviette da laboratorio per raschiare qualsiasi tessuto molle rimanente dal femore e dalla tibia e posizionarli nella piastra preparata con mem alfa posto sul ghiaccio. La dissezione deve essere eseguita con cura per ridurre al minimo la contaminazione.
Ecco perché la rimozione approfondita dei tessuti molli e la localizzazione ossea sono cruciali. Riempire una siringa ad ago calibro 30 con alpha MEM. Scollegare la tibia e il femore lontano dall'articolazione del ginocchio e tagliare le estremità dell'osso lungo da entrambi i lati usando le forbici.
Utilizzare una pinzetta per tenere l'osso dall'albero. Inserire l'ago nello spazio del midollo all'osso e sciacquare lentamente il contenuto del midollo in un piatto di coltura di sei centimetri e ripetere per tutte le ossa. L'osso diventerà bianco, indicando l'estrazione di tutto il contenuto di midollo osseo.
Utilizzare un colino a celle in nylon da 40 micrometri per filtrare l'estratto di midollo osseo in un tubo di centrifuga conica da 50 millilitri. Centrifugare il tubo a 300 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante.
Per lavare, aggiungere cinque millilitri di MEM alfa al pellet. Pipettare le cellule per staccarle, centrifughe e ripetere il lavaggio per un totale di due volte. Dopo aver contato queste cellule isolate, come descritto nel manoscritto, seminare 10 milioni di cellule per 10 millilitri, in un piatto di coltura di 10 centimetri, e aggiungere M-CSF alle cellule.
Incubare la coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per tre giorni. Rimuovere il mezzo dopo tre giorni e lavare le cellule due volte vigorosamente con 10 millilitri di PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Aggiungere cinque millilitri di temperatura ambiente allo 0,02% di tripsiderina-EDTA e PBS e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per cinque minuti.
Pipettare accuratamente le cellule per staccarle. Osservare la coltura al microscopio per assicurarsi che le cellule siano state staccate e appaiano arrotondate e fluttuanti nei supporti. Quando le cellule sono state staccate, disattivare la reazione aggiungendo cinque millilitri dell'alfa MEM.
Raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Dopo aver scartato il supernatante, lavare con cinque millilitri di MEM alfa e centrifugare di nuovo a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere di nuovo il pellet in 10 millilitri di MEM alfa.
Semina 1 milione di cellule per 10 millilitri in un piatto di coltura di 10 centimetri e aggiungi M-CSF. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per tre giorni. Raccogliere le cellule attaccate, che rappresentano i BBM come precursori dell'osteoclasta dopo tre giorni, come fatto in precedenza durante la generazione di BBM.
Seminare i BBM a 50.000 cellule per 200 micro litri di MEM alfa in una piastra di 96 pozzi per pozzo. Ad ogni bene, aggiungere gli stimoli desiderati. E poi aggiungere M-CSF per una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro.
Aggiungere anticorpo anti-c-fms ad ogni pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per quattro giorni, cambiando i supporti a giorni diversi per quattro giorni. E poi procedere con colorazione e saggi, come descritto nel manoscritto.
È stata valutata la formazione di osteoclasti nella coltura trattata con M-CSF e RANKL, con anticorpo Anti-c-fms. Con 101.000 nanogrammi per millilitro Anticorpo anti-c-fms, è stata osservata una significativa diminuzione del numero di osteoclasti rispetto al controllo. Mentre, con un anticorpo anti-c-fms su 10 per millilitro, non c'è stata alcuna diminuzione significativa.
Quindi, è stata valutata la formazione di osteoclasti nella coltura trattata con M-CSF e TNF alfa, con anticorpo Anti-c-fms. Con 10, 100, 1.000 nanogrammi per millilitro Anticorpo Anti-c-fms, è stata osservata una significativa diminuzione del numero di osteoclasti rispetto al controllo, senza alcuna diminuzione significativa a un nanogrammo per millilitro. E la coltura M-CSF con 1, 10, 100 nanogrammi per millilitro Anticorpo Anti-c-fms, non c'è stata alcuna diminuzione significativa del numero di precursori osteoclasti rispetto al controllo.
Tuttavia, a 1.000 nanogrammi per millilitro, c'è stata una significativa diminuzione del numero di precursori dell'osteoclasto, indicando che è necessaria una concentrazione fino a 1.000 nanogrammi per millilitro per inibire significativamente la proliferazione dei precursori dell'osteoclasto. Assicurati di liberare i legami mantenendo intatto l'osso, il che ridurrà al minimo la possibilità di contaminazione.
