この実験は、関節リウマチや歯腸炎などの炎症性骨破壊の疾患における抗c-fms抗体の治療価値を強調する。骨髄を抽出し、破骨前駆体を生成するために使用するプロセスは、複数の下流のアプリケーションで使用することができる純粋な破骨細胞を大量に生成します。このプロトコルは、RANKLリガンドまたはTNFアルファを使用して、骨切膜形成の2つの代替方法を提供する。
それに加えて、この方法は、骨鎖骨形成に対する抗c-fms抗体の効果に関する洞察を提供する。この手順の視覚的なデモンストレーションは、解剖および大量の骨髄細胞を得るプロセスに研究者を理解しています。容器の大きさに応じて約50ミリリットルのアルファMEMを用いた回収容器となるプレートを充填し、氷の上に置きます。
ピンを使用して安楽死させたマウスの手のひらと足を貫通して、スーピンの位置に固定し、70%エタノールで十分にスプレーします。無菌の外科用ハサミとピンセットを使用して、股関節のレベルで皮膚切開を行い、筋肉を露出させ、足まで伸ばします。四頭筋を付ける腱を見つけて切ります。
筋肉を剥がし、腰のレベルで切ります。その後、骨にハムストリングの筋肉を取り付ける腱を見つけます。骨を露出する筋肉を剥がし、ハムストリングを付着から解放し、骨に切り込まないようにします。
大腿骨の頭部と関節空間の間にはさみを置きます。大腿骨を解放するが、骨をそのまま維持し、骨髄を露出させるリスクなしに骨の剥離を可能にする。同様の方法で脛脛に取り付けられた筋肉を切り取ります。
その後、汚染を避けるために骨をそのまま保ちながら、足首関節の付着から脛骨を切り取ります。はさみブレードとラボワイプを使用して、大腿骨と脛骨から残っている軟部組織を削り取り、氷の上に置かれたアルファMEMで準備されたプレートに入れてください。汚染を最小限に抑えるために、解剖は慎重に行われるべきである。
そのため、徹底的な軟部組織除去と骨の局在化が重要です。アルファMEMで30ゲージ針の注射器を充填します。脛骨と大腿骨を膝関節から切り離し、はさみを使用して両側から長い骨の端を切断します。
ピンセットを使用して、シャフトから骨を保持します。骨に骨髄空間に針を挿入し、ゆっくりと6センチメートルの培養皿に骨髄の内容を洗い流し、すべての骨のために繰り返します。骨は白色になり、すべての骨髄含有量の抽出を示す。
40マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを使用して、骨髄抽出物を50ミリリットルの円錐形遠心分離管に歪まします。チューブを5分間Gの300倍に遠心分離する。上清を捨てます。
洗浄するには、5ミリリットルのアルファMEMをペレットに加えます。ピペット細胞を取り外し、遠心分離し、合計2回洗浄を繰り返します。これらの単離細胞を数えた後、原稿に記載されているように、10ミリリットル当たり1000万個の細胞を、10センチメートル培養皿に入れ、細胞にM-CSFを加える。
37°C、5%の二酸化炭素で3日間培養します。培地を3日後に取り出し、10ミリリットルのPBSで細胞を2回激しく洗い、非接着性細胞を除去する。室温0.02%トリプシンEDTAとPBSの5ミリリットルを加え、摂氏37度、5%の二酸化炭素で5分間インキュベートします。
細胞を徹底的にピペットして取り外します。顕微鏡で培養を観察し、細胞が剥離し、丸みを帯びて浮遊しているように見えるようにします。細胞が剥離したら、5ミリリットルのαMEMを添加して反応を不活性化する。
5分間Gの300倍で50ミリリットル円錐形チューブと遠心分離機に細胞を収集します。上清を捨て、5ミリリットルのアルファMEMで洗浄し、遠心分離機をGの300倍で5分間再び洗浄します。アルファMEMの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。
10センチメートルの培養皿で10ミリリットル当たり100万個の細胞をシードし、M-CSFを加えます。37°C、5%の二酸化炭素で3日間培養します。BBMの生成中に以前に行われたように、3日後に破骨前駆体としてBBMを表す付加細胞を収穫する。
BPMをアルファMEMの200マイクロリットルあたり50,000細胞に96ウェルプレートで播種します。各井戸に、所望の刺激を加える。そして、ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度のためのM-CSFを追加します。
各ウェルに抗c-fms抗体を追加します。1日おきに4日間メディアを交換しながら、プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素を4日間インキュベートします。そして、原稿に記載されているように、染色およびアッセイを進める。
M-CSFおよびRANKL処理培養における破骨細胞形成を、抗c-fms抗体を用いて、評価した。1ミリリットル当たり000ナノグラムの抗c-fms抗体を用いて、コントロールと比較して破骨細胞の数の有意な減少が観察された。一方、1ミリリットル当たり10ナノグラムに1個の抗c-fms抗体では、有意な減少はなかった。
次に、M-CSFおよびTNFα中の破骨細胞形成を処理培養し、抗c-fms抗体を用いて、評価した。1ミリリットルの抗c-fms抗体あたり10,100,1,000ナノグラムでは、1ミリリットル当たり1ナノグラムで有意な減少を伴い、対照と比較して破骨細胞の数の有意な減少が認められた。M-CSF培養物とはミリリットル当たり1,10,100ナノグラムの抗c-fms抗体で、対照と比較して破骨前駆体の数に有意な減少はなかった。
しかし、1ミリリットル当たり1,000ナノグラムでは、破骨細胞前駆体の数が有意に減少し、1ミリリットル当たり1,000ナノグラムの濃度が、破骨細胞前駆体の増殖を有意に阻害するために必要であることを示す。汚染の可能性を最小限に抑える骨をそのままにしたまま、ボンズを解放するようにしてください。
