抗结核抗体对骨细胞形成和骨细胞前体增殖的影响

本实验突出了抗c-fms抗体在炎症性骨质破坏性疾病（如风湿性关节炎和肠炎）的治疗价值。提取骨髓并用于产生骨质前体的过程，产生大量的纯骨质，可用于多种下游应用。该协议提供了两种骨质生成的替代方法，要么使用 RANKL 配体或 TNF alpha。

除此之外，该方法还提供了抗c-fms抗体对骨质生成的影响的洞察。这个程序的视觉演示使研究人员熟悉了大量解剖和获取骨髓细胞的过程。开始填充一个板，将作为一个收集容器与约50毫升的α MEM，根据容器的大小，并放在冰上。

使用针刺刺穿安乐死小鼠的手掌和脚，以固定其在超碱位置，并彻底喷洒70%乙醇。使用无菌手术剪刀和钳子在臀部水平做皮肤切口，并延伸到脚，暴露肌肉。找到并切割附着四头肌的肌腱。

剥去肌肉，在臀部水平切开。然后找到将腿筋肌肉附着在骨骼上肌腱。剥去露出骨头的肌肉，将腿筋从附件中释放，确保不要切入骨骼。

将剪刀放在股骨头部和关节空间之间。切入它释放股骨，但保持骨骼完好无损，这将使骨骼分离，而不会暴露骨髓的风险。以类似的方式切掉附着在头骨上肌肉的肌肉。

然后从脚踝关节的附件中切开头骨，同时保持骨骼完好无损，以避免污染。使用剪刀刀片和实验室湿巾从股骨和头骨中刮出剩余的软组织，并把它们放在准备好的盘子中，将α MEM放在冰上。应仔细进行解剖，以尽量减少污染。

这就是为什么彻底的软组织去除和骨定位是至关重要的。用α MEM 填充 30 量针注射器。断开头骨和股骨从膝关节，并切断长骨的两侧使用剪刀。

用钳子从轴上固定骨头。将针头插入骨髓空间到骨骼中，然后慢慢将骨髓的含量冲洗到六厘米的培养盘中，对所有骨骼进行重复。骨骼将变白，表示提取所有骨髓内容。

使用 40 微米尼龙细胞过滤器将骨髓提取物应变到 50 毫升锥形离心管中。将管子在300次G下离心5分钟。丢弃上一杯。

要清洗，在颗粒中加入五毫升α MEM。移液细胞分离，离心机，并重复洗涤共两次。计算这些分离细胞后，如手稿所述，在10厘米培养皿中每10毫升播种1000万个细胞，并将M-CSF添加到细胞中。

在37摄氏度，5%的二氧化碳孵育三天。三天后取出培养液，用10毫升PBS大力清洗细胞，取出非吸维细胞。加入室温的5毫升0.02%的三辛-EDTA和PBS，并在37摄氏度下孵育，5%的二氧化碳孵育5分钟。

彻底移液细胞以分离它们。在显微镜下观察培养物，确保细胞分离，在介质中出现圆形和浮动。当细胞分离时，通过加入五毫升的α MEM来灭活反应。

将细胞收集到50毫升锥形管中，以300次G离心5分钟。丢弃上经剂后，用五毫升的α MEM洗涤，并在300次G下再次离心5分钟。将颗粒重新悬浮在10毫升的α MEM中。

在10厘米培养皿中每10毫升播种100万个细胞，并加入M-CSF。在37摄氏度，5%的二氧化碳孵育三天。收获附着的细胞，这些细胞在三天后将BMS作为骨质前体，就像以前在BMM生成期间那样。

每200微升α MEM每200微升在96个井板中播种5万个BMM。在每个井，添加所需的刺激。然后添加M-CSF，最终浓度为每毫升100毫微克。

向每口井添加抗 c-fms 抗体。在37摄氏度下孵育，4天孵育5%的二氧化碳，同时每隔一天更换一次介质4天。然后继续进行染色和测定，如手稿中所述。

用抗c-fms抗体在M-CSF和 RANKL治疗培养中形成骨质形成。与对照相比，每毫升抗c-fms抗体为101，000毫微克，观察到骨细胞数量显著减少。然而，每毫升抗c-fms抗体每10毫微克分之一，没有显著减少。

然后，用抗c-fms抗体对M-CSF和TNFα治疗培养中的骨质原形成进行了评价。与对照组相比，每毫升抗c-fms抗体为10、100、1000毫微克，观察到骨细胞数量显著减少，每毫升1毫微克没有显著减少。与对照相比，M-CSF培养每毫升1、10、100毫微克的抗c-fms抗体，骨质原前体数量没有显著减少。

然而，每毫升1000毫微克，骨细胞前体的数量显著减少，表明需要高达每毫升1000毫微克的浓度，以显著抑制骨细胞前体的增殖。确保释放骨骼，同时保持骨骼完好无损，这将最大限度地减少污染的机会。