Bu deney, romatoid artrit ve periodontit gibi inflamatuar kemik bozulması hastalıklarında Anti-c-fms antikor terapötik değerini vurgulamaktadır. Kemik iliği ayıklanır ve osteoklast öncüleri oluşturmak için kullanılan süreci, birden fazla downstream uygulamalarında kullanılabilir saf osteoklastlar, büyük miktarlarda verir. Bu protokol, RANKL ligand veya TNF alfa kullanılarak osteoklaztogenezin iki alternatif yöntemini sağlar.
Buna ek olarak, bu yöntem osteoklaztogenez üzerinde Anti-c-fms antikor etkisi içine fikir sağlar. Bu prosedürün görsel gösterimi, araştırmacıyı diseksiyon süreci ve büyük miktarlarda kemik iliği hücrelerinin elde edilmesi ile yakından tır. Alfa MEM yaklaşık 50 mililitre ile bir toplama konteyner olarak hizmet verecek bir plaka doldurmak başlamak için, konteyner büyüklüğüne bağlı olarak, ve buz üzerine yerleştirin.
Supine pozisyonda düzeltmek için bir ötenazi farenin avuç içi ve ayaklarını delmek için iğneler kullanın ve % 70 etanol ile iyice sprey. Kalça düzeyinde bir deri kesi yapmak ve kasları açığa, ayaklar için aşağı uzatmak için steril cerrahi makas ve cımbız kullanın. Quadriceps kas takarak tendon bulmak ve kesmek.
Kas soyma ve kalça düzeyinde kesti. Sonra kemiğe hamstring kas bağlı tendon bulun. Kemiği açığa çıkaran kasları soyun ve kemiği kesmemelerini sağlayarak hamstring'i ekinden kurtarın.
Makası uyluk kemiğinin başı ile eklem boşluğu arasına yerleştirin. Femur serbest bırakarak içine kesilmiş, ama kemik bozulmadan tutmak, hangi kemik iliği açığa riski olmadan kemiklerin ayrılmasını sağlayacaktır. Kaval kemiğine bağlı kasları benzer bir şekilde kesin.
Daha sonra kaval kemiğini ayak bileği eklemindeki ekinden arındırArak, kontaminasyonu önlemek için kemiği sağlam tutarak kesin. Femur ve tibia kalan yumuşak doku kazımak ve buz üzerine yerleştirilen alfa MEM ile hazırlanan plaka ya da yerleştirmek için makas bıçakları ve laboratuvar mendil kullanın. Kontaminasyonu en aza indirmek için diseksiyon dikkatle yapılmalıdır.
Bu nedenle yumuşak doku çıkarılması ve kemik lokalizasyonu çok önemlidir. 30 kalibrelik bir iğne şırıngasına alfa MEM ile doldurun. Kaval kemiğini ve uyluk kemiğini diz ekleminden uzaklaştırın ve makas kullanarak uzun kemiğin uçlarını her iki taraftan kesin.
Kemiği şafttan tutmak için cımbız kullanın. İğneyi kemiğe ilik boşluğuna yerleştirin ve iliğin içeriğini yavaşça altı santimetrelik bir kültür yemeğine boşaltın ve tüm kemikler için tekrarlayın. Kemik beyaza dönecek, bu da tüm kemik iliği içeriğinin çıkarını gösteriyor.
Kemik iliği ekstresini 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne sokmak için 40 mikrometrelik naylon hücreli süzgeç kullanın. Tüpü 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın.
Yıkamak için, pelet alfa MEM beş mililitre ekleyin. Pipet hücreleri ayırmak için, santrifüj, ve iki kez toplam yıkama tekrarlayın. Bu izole hücreleri sayarak, el yazmasında açıklandığı gibi, 10 mililitrede 10 milyon hücre tohum, 10 santimetrelik bir kültür kabına tohum ve hücrelere M-CSF ekleyin.
Kültürü 37 derecede kuluçkaya yatırın, üç gün boyunca %5 karbondioksit. Üç gün sonra ortamı çıkarın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez şiddetle yıkayın. Oda sıcaklığında beş mililitre ekleyin 0.02%tripsin-EDTA ve PBS, ve inkübat 37 santigrat derece, 5% 5 karbondioksit beş dakika için.
Hücreleri ayırmak için iyice pipetleyin. Hücrelerin ayrılmış olduğundan ve medyada yuvarlak ve yüzer göründüğünden emin olmak için kültürü mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler ayrıldıklarında, alfa MEM beş mililitre ekleyerek reaksiyon inaktive.
Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüp ve santrifüj içine toplayın 300 kez G beş dakika için. Supernatant attıktan sonra, alfa MEM beş mililitre ile yıkayın ve beş dakika boyunca 300 kez G tekrar santrifüj. 10 mililitre lik alfa MEM'de peleti yeniden askıya alın.
10 santimetrelik bir kültür kabında 10 mililitrede 1 milyon hücre tohumlayın ve M-CSF ekleyin. Kültürü 37 derecede kuluçkaya yatırın, üç gün boyunca %5 karbondioksit. Üç gün sonra Osteoklast öncüleri olarak MM'leri temsil eden bağlı hücreleri hasat edin, daha önce KİM'lerin üretimi sırasında olduğu gibi.
Tohum 50, 000 hücre başına 200 mikro alfa MEM litre başına 96 iyi plaka başına. Her iyi için, istenilen uyaranları ekleyin. Ve sonra mililitre başına 100 nanogram son konsantrasyon için M-CSF ekleyin.
Her kuyuya Anti-c-fms antikor ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede, dört gün boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın ve dört gün boyunca her gün ortam değiştirin. Ve sonra el yazmasında açıklandığı gibi boyama ve tahliller ile devam edin.
Anti-c-fms antikorlu M-CSF ve RANKL tedavi kültüründe osteoklast oluşumu değerlendirildi. Mililitre Anti-c-fms antikor başına 101,000 nanogram ile kontrole göre osteoklast sayısında önemli bir azalma gözlenmiştir. Oysa mililitre Anti-c-fms antikorbaşına 10 nanogramda bir azalma yoktu.
Daha sonra Anti-c-fms antikorlu M-CSF ve TNF alfa tedavi kültüründe osteoklast oluşumu değerlendirildi. Mililitre Anti-c-fms antikor başına 10, 100, 1, 000 nanogram ile, osteoklast sayısında önemli bir azalma gözlendi kontrol göre, mililitre başına bir nanogram önemli bir azalma ile. Ve mililitre Anti-c-fms antikor başına 1, 10, 100 nanogram ile M-CSF kültürü, kontrol ile karşılaştırıldığında osteoklast öncüleri sayısında önemli bir azalma yoktu.
Ancak, mililitre başına 1,000 nanogram, osteoklast öncüleri sayısında önemli bir azalma vardı, mililitre başına 1, 000 nanogram gibi yüksek bir konsantrasyon önemli ölçüde osteoklast öncüleri çoğalmasını inhibe etmek için gerekli olduğunu belirten. Kemiği bozulmadan tutarken bağları serbest bıraktıklarından emin olun, bu da kontaminasyon olasılığını en aza indirecektir.
