Dieses Experiment unterstreicht den therapeutischen Wert von Anti-c-fms Antikörpern bei Erkrankungen entzündlicher Knochenstörungen wie rheumatoider Arthritis und Parodontitis. Das Verfahren, durch das Knochenmark extrahiert und zur Erzeugung von Osteoklastvorläufern verwendet wird, ergibt große Mengen reiner Osteoklasten, die in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden können. Dieses Protokoll bietet zwei alternative Methoden der Osteoclastogenese, entweder mit RANKL Ligand oder TNF alpha.
Darüber hinaus bietet diese Methode Einblick in die Wirkung von Anti-c-fms-Antikörpern auf die Osteoclastogenese. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens macht den Forscher mit dem Prozess der Zerlegung und der Gewinnung von Knochenmarkzellen in großen Mengen vertraut. Um eine Platte zu füllen, die als Sammelbehälter mit ca. 50 Milliliter alpha MEM dienen wird, abhängig von der Größe des Behälters, und legen Sie sie auf Eis.
Verwenden Sie Stifte, um durch die Handflächen und Füße einer eingeschläferten Maus zu durchdringen, um sie in Supine-Position zu fixieren, und sprühen Sie gründlich mit 70% Ethanol. Verwenden Sie sterile chirurgische Schere und Pinzette, um einen Hautschnitt auf der Ebene der Hüfte zu machen und sie bis zu den Füßen zu erweitern, die Muskeln freizulegen. Suchen und schneiden Sie die Sehne, die den Quadrizepsmuskel befestigt.
Den Muskel abziehen und auf hüfthöhe schneiden. Dann lokalisieren Sie die Sehne, die den Hamstring-Muskel am Knochen befestigt. Schälen Sie die Muskeln, die den Knochen freisetzen, und befreien Sie die Sehne von ihrer Befestigung, um sicherzustellen, dass sie nicht in den Knochen geschnitten wird.
Positionieren Sie die Schere zwischen dem Kopf des Oberschenkelknochens und dem Gelenkraum. Schneiden Sie in sie befreien den Oberschenkelknochen, aber halten Sie den Knochen intakt, die Ablösung der Knochen ermöglicht, ohne das Risiko der Exposition des Knochenmarks. Schneiden Sie die Muskeln an der Tibia in ähnlicher Weise befestigt.
Dann schneiden Sie die Tibia frei von seiner Befestigung am Sprunggelenk, während sie den Knochen intakt hält, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie die Scherenklingen und Labortücher, um das verbleibende Weichgewebe aus dem Oberschenkelknochen und der Tibia zu kratzen und legen Sie es in die vorbereitete Platte mit Alpha MEM auf Eis gelegt. Die Sezierung sollte sorgfältig durchgeführt werden, um die Kontamination zu minimieren.
Deshalb sind eine gründliche Weichteilentfernung und Knochenlokalisierung von entscheidender Bedeutung. Füllen Sie eine 30-Spur-Nadelspritze mit alpha MEM. Trennen Sie die Tibia und Oberschenkel von der Kniegelenk, und schneiden Sie die Enden des langen Knochens von beiden Seiten mit einer Schere.
Verwenden Sie eine Pinzette, um den Knochen aus der Welle zu halten. Setzen Sie die Nadel in den Knochendesmarkeinraum ein und spülen Sie den Inhalt des Marks langsam in eine sechs Zentimeter große Kulturschale und wiederholen Sie ihn für alle Knochen. Der Knochen wird weiß, was auf die Extraktion des gesamten Knochenmarkgehalts hinweist.
Verwenden Sie ein 40 Mikrometer Nylon-Zellsieb, um den Knochenmarkextrakt in ein 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr zu sanieren. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.
Zum Waschen fünf Milliliter Alpha MEM in das Pellet geben. Pipette die Zellen, um sie zu lösen, Zentrifuge, und wiederholen Sie die Wäsche für insgesamt zwei Mal. Nach dem Zählen dieser isolierten Zellen, wie im Manuskript beschrieben, säen Sie 10 Millionen Zellen pro 10 Milliliter in einer 10-Zentimeter-Kulturschale aus und fügen M-CSF zu den Zellen hinzu.
Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für drei Tage. Entfernen Sie das Medium nach drei Tagen, und waschen Sie die Zellen zweimal kräftig mit 10 Milliliter PBS, um nicht haftende Zellen zu entfernen. Fügen Sie fünf Milliliter Raumtemperatur 0,02%Trypsin-EDTA und PBS hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für fünf Minuten.
Gründlich Pipette die Zellen, um sie zu lösen. Beobachten Sie die Kultur unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen getrennt wurden und gerundet und in den Medien schwebend erscheinen. Wenn die Zellen abgetrennt wurden, inaktivieren Sie die Reaktion, indem Sie fünf Milliliter des Alpha-MEM hinzufügen.
Sammeln Sie die Zellen in einem 50 Milliliter konischen Rohr und Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten. Nach dem Wegwerfen des Überstandes mit fünf Milliliteralpha MEM waschen und fünf Minuten lang wieder bei 300 mal G zentrieren. Das Pellet in 10 Milliliter Alpha MEM wieder aufhängen.
Samen 1 Million Zellen pro 10 Milliliter in einem 10-Zentimeter-Kulturgericht, und fügen Sie M-CSF. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für drei Tage. Ernten Sie die angeschlossenen Zellen, die BMMs als Osteoklast-Vorstufen nach drei Tagen darstellen, wie es zuvor bei der Erzeugung von BMMs geschehen ist.
Säen Sie die BMMs bei 50.000 Zellen pro 200 Mikroliter alpha MEM in einer 96-Well-Platte pro Brunnen. Zu jedem Brunnen, fügen Sie gewünschte Reize. Und dann M-CSF für eine endige Konzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen.
Fügen Sie Anti-c-fms Antikörper zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für vier Tage, während medienwechseln jeden zweiten Tag für vier Tage. Und dann gehen Sie mit Färbung und Assays, wie in der Handschrift beschrieben.
Die Osteoklastbildung in m-CSF und RANKL behandelten Kultur, mit Anti-c-fms Antikörper, wurde bewertet. Mit 101.000 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms-Antikörper wurde im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Abnahme der Anzahl von Osteoklasten beobachtet. Während bei einem von 10 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper, gab es keine signifikante Abnahme.
Anschließend wurde die Osteoklastbildung in der Alpha-behandelten M-CSF- und TNF-Alphakultur mit Anti-c-fms-Antikörper bewertet. Mit 10, 100, 1 000 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper wurde eine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklasten im Vergleich zur Kontrolle beobachtet, ohne signifikante Abnahme bei einem Nanogramm pro Milliliter. Und die M-CSF-Kultur mit 1, 10, 100 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper, gab es keine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklast-Vorstufen im Vergleich zur Kontrolle.
Bei 1 000 Nanogramm pro Milliliter war jedoch eine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklast-Vorläufer zu verzeichnen, was darauf hindeutet, dass eine Konzentration von bis zu 1.000 Nanogramm pro Milliliter erforderlich ist, um die Proliferation von Osteoklast-Vorstufen signifikant zu hemmen. Achten Sie darauf, die Bindungen zu befreien, während Sie den Knochen intakt halten, was die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination minimiert.
