Este experimento destaca o valor terapêutico do anticorpo Anti-c-fms em doenças de ruptura óssea inflamatória, como artrite reumatoide e periodontite. O processo pelo qual a medula óssea é extraída e usada para gerar precursores osteoclatos, produz grandes quantidades de osteoclartos puros, que podem ser usados em múltiplas aplicações a jusante. Este protocolo fornece dois métodos alternativos de osteoclastogênese, seja usando ligante RANKL ou TNF alfa.
Além disso, este método fornece uma visão do efeito do anticorpo Anti-c-fms na osteoclastogênese. A demonstração visual desse procedimento familiariza o pesquisador com o processo de dissecção e obtenção de células de medula óssea em grandes quantidades. Para começar a encher uma placa que servirá como um recipiente de coleta com aproximadamente 50 mililitros de mem alfa, dependendo do tamanho do recipiente, e colocá-lo no gelo.
Use pinos para perfurar as palmas das mãos e pés de um rato eutanizado para fixá-lo em posição supina, e pulverizar completamente com 70% de etanol. Use tesoura cirúrgica estéril e pinça para fazer uma incisão da pele ao nível do quadril e estenda-a até os pés, expondo os músculos. Localize e corte o tendão que prende o músculo quadríceps.
Retire o músculo e corte-o ao nível do quadril. Em seguida, localize o tendão anexando o músculo do tendão ao osso. Retire os músculos expondo o osso, e liberte o tendão de seu apego, certificando-se de não cortar no osso.
Posicione a tesoura entre a cabeça do fêmur e o espaço articular. Corte nele liberando o fêmur, mas mantendo o osso intacto, o que permitirá o descolamento dos ossos sem risco de expor a medula óssea. Corte os músculos presos à tíbia de forma semelhante.
Em seguida, corte a tíbia livre de sua fixação na articulação do tornozelo, mantendo o osso intacto para evitar contaminação. Use as lâminas da tesoura e os lenços de laboratório para raspar qualquer tecido mole restante do fêmur e tíbia e coloque-os na placa preparada com MEM alfa colocado no gelo. A dissecção deve ser realizada cuidadosamente para minimizar a contaminação.
É por isso que a remoção completa do tecido mole e a localização óssea são cruciais. Encha uma seringa de agulha calibre 30 com mem alfa. Desconecte a tíbia e o fêmur da articulação do joelho, e corte as extremidades do osso longo de ambos os lados usando uma tesoura.
Use pinças para segurar o osso do eixo. Insira a agulha no espaço da medula ao osso e lave lentamente o conteúdo da medula em um prato de cultura de seis centímetros e repita para todos os ossos. O osso ficará branco, indicando a extração de todo o teor de medula óssea.
Use um coador de células de nylon de 40 micrômetros para esticar o extrato da medula óssea em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Centrifugar o tubo a 300 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernaspeso.
Para lavar, adicione cinco mililitros de MEM alfa à pelota. Pipeta as células para desprender, centrífuga, e repetir a lavagem por um total de duas vezes. Depois de contar essas células isoladas, como descrito no manuscrito, semente 10 milhões de células por 10 mililitros, em um prato de cultura de 10 centímetros, e adicionar M-CSF às células.
Incubar a cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por três dias. Remova o meio após três dias e lave as células duas vezes vigorosamente com 10 mililitros de PBS para remover células não aadeentes. Adicione cinco mililitros de temperatura ambiente 0,02% trypsin-EDTA e PBS, e incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por cinco minutos.
Pipeta completamente as células para desprender. Observe a cultura sob um microscópio para garantir que as células tenham sido separadas e apareçam arredondadas e flutuando na mídia. Quando as células foram separadas, inativa a reação adicionando cinco mililitros do MEM alfa.
Colete as células em um tubo cônico de 50 mililitros e centrífuga a 300 vezes G durante cinco minutos. Depois de descartar o supernaspe, lave com cinco mililitros de alfa MEM, e centrífuga novamente a 300 vezes G por cinco minutos. Suspenda a pelota em 10 mililitros de alfa MEM.
Semente 1 milhão de células por 10 mililitros em um prato de cultura de 10 centímetros, e adicionar M-CSF. Incubar a cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por três dias. Colher as células anexadas, que representam os BMMs como precursores osteoclatos após três dias, como feito anteriormente durante a geração de BMMs.
Semente os BMMs a 50.000 células por 200 micro litros de MEM alfa em uma placa de 96 poços por poço. A cada poço, adicione estímulos desejados. E então adicione M-CSF para uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro.
Adicione anticorpo Anti-c-fms a cada poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por quatro dias, enquanto muda a mídia a cada dois dias durante quatro dias. E, em seguida, proceder com manchas e ensaios, como descrito no manuscrito.
Foi avaliada a formação osteoclasta na cultura tratada M-CSF e RANKL, com anticorpo Anti-c-fms. Com 101.000 nanogramas por anticorpo anti-c-fms mililitro, observou-se uma diminuição significativa no número de osteoclatos em comparação com o controle. Considerando que, com um em cada 10 nanogramas por anticorpo anti-c-fms mililitro, não houve diminuição significativa.
Em seguida, foi avaliada a formação osteoclasta na cultura tratada alfa M-CSF e TNF, com anticorpo Anti-c-fms. Com 10, 100, 1.000 nanogramas por anticorpo anti-c-fms mililitro, observou-se uma diminuição significativa no número de osteoclatos em comparação com o controle, sem diminuição significativa em um nanograma por mililitro. E a cultura M-CSF com 1, 10, 100 nanogramas por anticorpo anti-c-fms mililitro, não houve diminuição significativa no número de precursores osteoclades em comparação com o controle.
No entanto, a 1.000 nanogramas por mililitro, houve uma diminuição significativa no número de precursores do osteoclato, indicando que uma concentração de até 1.000 nanogramas por mililitro é necessária para inibir significativamente a proliferação de precursores osteoclatos. Certifique-se de liberar as ligações mantendo o osso intacto, o que minimizará a chance de contaminação.
