רטינופתיה סוכרתית היא הסיבוך המיקרוווסקולרי הנפוץ ביותר של סוכרת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על הפתופיזיולוגיה של מחלת השלב הסופי רטינופתיה סוכרתית מתפשטת. טכניקה זו מאפשרת פירוק של נוף הרקמות התלת מימדי המקומי וחקירה של פתופיזיולוגיה של רקמות בחומר חולה חי עם רלוונטיות קלינית ישירה. עיין בפרוטוקול הטקסט לקבלת פרטים על הניתוח ועל המכשור המשמש בניתוח. כדי להתחיל, מניחים רקמה פיברווסקולרית כי כבר הוצאו מן הנבדקים האנושיים שעברו ניתוח microincision vitreoretinal transconjunctival בצלחת תרבות התא המכיל PBS סטרילי. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ניתוח זקוף, לחתוך את הרקמה הפיברווסקולרית לחתיכות מילימטר מרובע בערך. להטביע את הרקמה ב- PBS ולהחזיק את הרקמה במקום עם פינצטה זעירה. לעשות חתכים ברורים ברקמה עם אזמל סטרילי דואג כדי למנוע קריעת הרקמה fibrovascular. מניחים כל פיסת רקמה בודדת לתוך באר של צלחת תרבות תאים 12 היטב המכיל מיליליטר אחד של PBS סטרילי. ראשית, להכין 25 aliquots microliter של פתרון פיברינוגן בטמפרטורת החדר. מניחים חתיכה אחת של רקמה פיברווסקולרית במרכז באר של צלחת 24 היטב ולהסיר כל PBS עודף. לאחר מכן, להוסיף 25 microliters של פתרון ת"א לאחד aliquots פיברינוגן מוכן. ושימוש בפיפה אחרת מוגדרת ל-50 מיקרוליטרים מתערבבים על ידי צינורות. מחלקים את התערובת על פיסת רקמת פיברווסקולרית ופיגט למעלה ולמטה כדי לבטח את חתיכת הרקמה כלולה בתוך טיפה. הזמן של היווצרות פיברינוגן קריטי עבור התלת מימדיות של תרבות ex vivo, נבדק טיפה ריקה לפני הטמלת רקמות כמתואר בפרוטוקול. דגירה הצלחת באינקובטור תרבות התא. לאחר 30 עד 60 דקות להטות את הצלחת כדי לבדוק כי ג'ל פיברין נוצר לחלוטין. לאחר מכן, כיסוי ג'ל פיבריווסקולרי פיברין רקמה עם תרבות vivo לשעבר בינוני בתוספת אפרוטין. לאחר מכן, החזירו את לוחות התרבות לאנקובטור תרבות התאים לתקופת הזמן הרצויה. ראשית, להחליף את המדיום תרבות vivo לשעבר עם מיליליטר אחד של פתרון paraformaldehyde לכל באר כדי לתקן את התרבויות. לאחר שעה, יש לשטוף את הג'לים בשלושה שטיפות PBS של חמש דקות. לאחר מכן, להחליף את לשטוף PBS עם שני מיליליטר של פתרון נתרן אזיד ל הבא. לאחסן את הג'לים קבועים בארבע מעלות צלזיוס.השתמש מרית קצה בריבוע נירוסטה כדי להרים את טיפות מהצלחת בזהירות, החל בקצוות לפני הרמת מרכז טיפה. באמצעות מרית עגולה קצה להעביר את טיפות בארות בודדות של צלחת 12 באר המכיל מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, להטות את הצלחת על תמיכה postfix טיפות עם מיליליטר אחד של אצטון קר כקרח פתרון מתנול לדקה אחת. לאחר מכן, לשטוף עם שלושה עד חמישה שטיפות מיליליטר של PBS. צנטריפוגה פתרון החסימה במשך 15 דקות כדי להסיר את כל הפסולת. לאחר מכן, להטות את הצלחת על תמיכה דגירה טיפות ב 500 microliters של פתרון חסימה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. מכינים את תערובת הנוגדנים העיקרית על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן השתמש מרית מעוגל קצוות להעביר את טיפות לתחתית עגולה 96 צלחת היטב. דגירה טיפות ב 30 microliters של תערובת נוגדנים ראשונית לכל טיפה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להעביר את טיפות 12 צלחת גם המכיל שני מיליליטר של פתרון כביסה ל הבאר. שוטפים את הטיפות בשלושה שטיפות של חמש דקות. לאחר מכן, לשטוף את טיפות עם תשעה שטיפות 30 דקות. למחרת, לשטוף את טיפות שלוש פעמים עם PBS. הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית המתאימה עם פלואורופור בהתאם לפרוטוקול הטקסט. מעבירים את טיפות לתחתית עגולה 96 גם צלחת, כפי שהוכח בעבר, ולהדגיר את הצלחת עם 30 microliters של תערובת נוגדנים משנית במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.לאחר ארבע שעות, מעבירים את טיפות 12 צלחת גם המכיל שני מיליליטר של פתרון כביסה לגם. ראשית, לשטוף את טיפות עם שלוש שטיפות חמש דקות. לאחר מכן, לשטוף את טיפות עם ארבע שטיפות 30 דקות. למחרת, לשטוף את טיפות חמש פעמים עם פתרון כביסה במשך 30 דקות, ושלוש פעמים עם PBS במשך 30 דקות. למחרת, להעביר את טיפות לתחתית עגולה 96 צלחת גם, כפי שהוכח בעבר. נטרל את טיפות עם כתם גרעיני Hoechst במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את טיפות לצלחת 12 באר המכיל שני מיליליטר של PBS לגם ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, יש למרוח שכבה צרה של מדיום הרכבה מהיר לאורך הקצוות של זכוכית כיסוי מרובעת ולאפשר לו להתייבש במשך דקה אחת. לאחר מכן, לשטוף את טיפה על ידי טבילת אותו לתוך באר של צלחת 12 גם המכיל מים deionized. ולהעביר את טיפת לשקופית מיקרוסקופ. לאחר מכן, מחלקים 15 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום לא התקשות על טיפה. מקם בעדינות את זכוכית הכיסוי מעל טיפת הירידה כאשר מדיום ההרכבה פונה לשקופית ותן לה להתיישב. תן את המגלשות להתייבש במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה. לבסוף, תמונה השקופיות עם מיקרוסקופ epifluorescence זקוף מצויד פונקציית חתך אופטי ב 20x או 40x המטרה. בפרוטוקול זה רקמת פיברווסקולרית הוכן והודמי. הנתונים הייצוגיים הראו כי תרבות PDR ex vivo גורמות להפקעת אנדותל חיובי CD-31 ושימור כלי דם בתגובה ל- VEGFA. לעומת זאת, TGF
