עבודה זו נתמכה על ידי התמיכה הכספית של קרנות ייזום מחקר דוקטורט שסופקו על ידי אוניברסיטת סין מערב נורמלי (מס '20E059).

1. הכנת תבנית הגן PRRSV
<ol><li>הפשיר את מלאי הנגיף ב 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>מוסיפים 0.2 מ"ל כלורופורם ומערבבים היטב. דוגרים במשך 3 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה את התערובת במשך 15 דקות ב 12,000 × גרם ב 4 ° C. הערה: התערובת מחולקת לשלושה שלבים, כלומר, שלב מימי חסר צבע, שלב בין-פאזי ושלב פנול-כלורופורם אדום.</li>
	<li>מוציאים את הפאזה המימית חסרת הצבע החוצה ומעבירים אותה לצינור חדש.</li>
	<li>מערבבים היטב את הפאזה המימית עם 0.5 מ"ל איזופרופנול ודגרים במשך 10 דקות ב-4°C.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-12,000 × גרם ב-4°C. הערה: בתחתית הצינור יש משקע RNA לבן.</li>
	<li>השתמש micropipette כדי להשליך את supernatant של הצינור.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של אתנול 75% כדי להשעות מחדש את הגלולה ואת המערבולת לזמן קצר.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-7,500 × גרם ב-4°C. השתמש micropipette כדי להשליך את supernatant של הצינור.</li>
	<li>יבשו את הרנ"א למשך 5 דקות, הוסיפו 20-50 מיקרוליטר מים נטולי RNase כדי להשהות מחדש את הרנ"א, וערבבו היטב.</li>
	<li>המשך לביצוע תמלול הפוך; הגדר את התגובות לביצוע שעתוק לאחור כפי שמוצג בטבלה 1. הערה: כדי להבטיח שעתוק לאחור מוצלח, השתמש בתבניות RNA באיכות גבוהה.</li>
	<li>השתמש cDNA שנוצר עבור PCR או לאחסן אותו ב -20 ° C.</li>
</ol>2. עיצוב פריימר PCR
<ol><li>עיצוב הפריימר הקדמי<ol><li>פתח את התוכנה ובחר קובץ DNA חדש.</li>
		<li>הדבק את רצף הגנים PRRSV (GenBank: FJ548852.1) מ- NCBI לתוך התוכנה. לחץ על OK ליצירת קובצי הרצף.</li>
		<li>נתח את הרצף וסמן את צמתי השברים. עצבו את פריימר הרצף הספציפי קדימה של השברים. ברוב המקרים, טמפרטורת ההתכה העדיפה (Tm) היא בין 55 °C (55 °F) ל 62 °C (75 °F), ותכולת GC היא 40-60%.</li>
		<li>לחץ על פריימרים ובחר הוסף פריימר.</li>
		<li>הדבק את הרצף הספציפי והוסף רצפים חופפים של הווקטור לנוקלאוטיד 5' הראשון של פריימר הרצף הספציפי. ליד כל צומת, בחר 20-40 bp כדי לשמש כאזור החפיפה בין שני השברים הסמוכים.</li>
		<li>תן שם לפריימר הקדמי המכיל את התלויות ואת הרצף הספציפי (ראה איור משלים S1).</li>
		<li>לחץ על הוסף פריימר לתבנית.</li>
	</ol></li>
	<li>עיצוב פריימר הפוך<ol><li>נתח את הרצף וסמן את צמתי השבר בתוכנה. עצבו את פריימר הרצף הספציפי ההפוך של השברים.</li>
		<li>לחץ על פריימרים ובחר הוסף פריימר.</li>
		<li>הדבק את הרצף הספציפי והוסף את אתר ההגבלה לנוקלאוטיד 5' הראשון של פריימר הרצף הספציפי. הערה: אתרי ההגבלה שנוספו חייבים להיעדר מקטע ההוספה ומהווקטור, למעט אתרי השכפול המרובים.</li>
		<li>הוסף רצפים של 20-40 bp של וקטורים לנוקלאוטיד 5' הראשון של אתר ההגבלה.</li>
		<li>תן שם לפריימר ההפוך המכיל את התלויות ואת הרצף הספציפי (ראה איור משלים S1).</li>
		<li>לחץ על הוסף פריימר לתבנית.</li>
	</ol></li>
</ol>3. PCR להגברת שברים
<ol><li>הגדר שש תגובות PCR נפרדות (טבלה 2): עבור מקטע 1, השתמש בפריימרים P1 ו- P2 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 2, השתמש בפריימרים P3 ו- P4 (ראה איור משלים S2); עבור מקטע 3, השתמש בפריימרים P5 ו- P6 (ראה איור משלים S2); עבור מקטע 4, השתמש בפריימרים P7 ו- P8 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 5, השתמש פריימרים P9 ו P10; והשתמשו בפריימרים P11 ו-P12 כדי להגביר את קטע 6 (ראו איור משלים S2). הערה: הפשרה, ערבב וצנטריפוגה קצרה כל רכיב לפני השימוש.</li>
	<li>הפעל את ה- PCR באמצעות פרוטוקול שלושת השלבים בטבלה 2.</li>
	<li>הוסף 1 μL של מאגר טעינת DNA 6x ל 5 μL של מוצר PCR, ערבב וצנטריפוגה קצרה את התכולה.</li>
	<li>נתח את הדגימות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.</li>
</ol>4. טיהור שברי PCR
הערה: טיהור מוצרי PCR מג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראה טבלת חומרים) חשוב לבניית וקטור.
<ol><li>הוסף 9 μL של מאגר טעינת DNA 6x ל- 45 μL של מוצרי PCR, ערבב וצנטריפוגה קצרה את התכולה.</li>
	<li>בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז / גולדוויו 1% כדי להפריד את מקטעי ה- DNA. הערה: אין לעשות שימוש חוזר במאגר פועל TAE מכיוון שערך ה- pH שלו ישפיע על שחזור מקטע DNA.</li>
	<li>לאחר הפרדה נאותה של להקות, השתמש באזמל חד כדי להסיר בזהירות את רצועות ה- DNA. הערה: מזערו את גודל פרוסת הג'ל על ידי חיתוך עודפי אגרוז.</li>
	<li>שוקלים את פרוסת הג'ל בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מ"ל, מוסיפים נפח שווה של חיץ קשירה לפרוסת הג'ל (למשל, 0.3 מ"ל לפרוסה של 0.3 גרם), ודגרים בטמפרטורה של 60°C למשך 7 דקות.</li>
	<li>הכנס עמודה קטנה בצינור איסוף של 2 מ"ל. הוסף 700 μL של תמיסת DNA/agarose משלב 4.4 לעמודה הקטנה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 10,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.</li>
	<li>הוסף 300 μL של חיץ קישור וצנטריפוגה ב 13,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.</li>
	<li>הוסף 700 μL של חיץ כביסה וצנטריפוגה ב 13,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השליכו את התסנין ועשו שימוש חוזר בצינור האיסוף.</li>
	<li>סובב את העמודה הקטנה הריקה למשך 2 דקות במהירות מרבית כדי לייבש את מטריצת העמודות. מניחים את העמוד הקטן בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 20 μL של מים deionized ישירות למרכז קרום עמוד ולתת לשבת בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות. צנטריפוגה במהירות של 13,000 × גרם למשך דקה.</li>
	<li>אחסן את ה- DNA ב -20 ° C.</li>
</ol>5. הכנת וקטור ליניארי
הערה: לאחר הכנת הפלסמיד, ניתן להשתמש באנזימים שנבחרו כדי לחתוך אותו. עיכול ארוך או עיכול אנזימי כפול חיוניים להבטחת העיכול של כל הדנ"א. זה יפחית את מספר השיבוטים החיוביים הכוזבים בניסויים הבאים.
<ol><li>ליניאריזציה של pVAX1
	<ol><li>הכינו את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר בסדר המצוין (טבלה 3). הערה: יש להוסיף את נפח המים כדי לשמור על נפח התגובה הכולל שצוין. כאן, 1 מיקרוגרם של פלסמיד התעכל עם אנזימים בתערובת התגובה. בהתאם לריכוז הפלסמיד, ניתן להתאים את נפח הפלסמיד בתערובת התגובה.</li>
		<li>מערבבים בעדינות; ואז לסובב למטה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בבלוק חום או בתרמוסטט מים למשך 60 דקות.</li>
		<li>בצע טיהור ג'ל בדומה לטיהור שברי PCR בסעיף 4 באמצעות ערכת מיצוי הג'ל (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>ליניאריזציה של pVAX1-F1 הערה: pVAX1-F1 הוא הווקטור המתקבל מהסבב הראשון של pVAX1 (NdeI ו-HindIII) ומקטע 1 מחדש. pVAX1-F2 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F1 (NdeI) ומקטע 2 רקומבינציה. pVAX1-F3 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F2 (NdeI) ומקטע 3 רקומבינציה. pVAX1-F4 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F3 (NdeI) ומקטע 4 רקומבינציה. pVAX1-F5 הוא הווקטור המתקבל מהסבב של pVAX1-F4 (EcoRV ו-NtoI) ומקטע 5 רקומבינציה.<ol><li>עבור כל וקטור, הכינו את תערובת התגובה בנפרד בטמפרטורת החדר בסדר המצוין (טבלה 3).</li>
		<li>מערבבים בעדינות; ואז לסובב למטה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בבלוק חום או בתרמוסטט מים למשך 60 דקות.</li>
		<li>בצע טיהור ג'ל בדומה לטיהור שברי PCR בסעיף 4 באמצעות ערכת מיצוי הג'ל (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
</ol>6. שיבוט לווקטור חדש
הערה: ניתן להשיג יעילות שיבוט טובה בעת שימוש ב- 50-200 ng של וקטור ותוספות.
<ol><li>הגדר את תגובת השכפול וההרכבה החלקה של ExonArt (טבלה 4). התאם את נפח התגובה הכולל ל- 10 μL באמצעות H2O מעוקר ומערבב.</li>
	<li>לדגור את התגובה thermocycler במשך 15-60 דקות ב 50 ° C. אחסנו את הדגימות על קרח. הערה: הארכת הדגירה עד 60 דקות עשויה לשפר את יעילות ההרכבה.</li>
	<li>הפשירו DH5α תאים בעלי כשירות כימית על קרח.</li>
	<li>להוסיף 10 μL של מוצר הרכבה לתאים המוסמכים; לאחר מכן, מערבבים בעדינות על ידי פיטום למעלה ולמטה.</li>
	<li>מניחים את התערובת על קרח למשך 30 דקות.</li>
	<li>יש לחמם ב-45°C למשך 45 שניות ולהעביר את הצינורות לקרח למשך 3 דקות.</li>
	<li>הוסף 900 μL של מדיום SOC לצינור.</li>
	<li>נערו את הצינור במהירות 225 סל"ד למשך שעה באינקובטור רעד בטמפרטורה של 37°C.</li>
	<li>צנטריפוגה את תגובת הטרנספורמציה ב 6,000 × גרם במשך 2 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של תווך SOC טרי.</li>
	<li>פזרו את תרחיף התא שעבר טרנספורמציה על צלחת LB נפרדת עם קנמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
	<li>לדגור על כל הצלחות למשך הלילה ב 37 ° C. בחר מושבות בודדות בודדות מכל צלחת ניסוי.</li>
</ol>7. ניתוח הטרנספורמטורים
<ol><li>בחר שמונה מושבות לתוך 20 μL של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin.</li>
	<li>הגדר את תגובת ה-PCR של המושבה והפעל את ה-PCR (טבלה 5). הערה: עבור תגובת PCR של המושבה עבור קטע 1, השתמש בפריימרים P1 ו- P2 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 2, השתמש בפריימרים P3 ו- P4 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 3, השתמש בפריימרים P5 ו- P6 (ראה קובץ משלים 1); עבור מקטע 4, השתמש בפריימרים P7 ו- P8 (ראה איור משלים S2); עבור קטע 5, השתמש פריימרים P9 ו P10; והשתמשו בפריימרים P11 ו-P12 כדי לזהות את מקטע 6 (ראו איור משלים S2).</li>
	<li>הוסף 1 μL של 6x מאגר טעינת DNA ל 5 μL של מוצר PCR, לערבב, ו צנטריפוגה קצרה את התוכן.</li>
	<li>נתח את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.</li>
	<li>בחר מושבה חיובית אחת לתוך 5 מ"ל של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ולגדול בן לילה ב 37 ° C.</li>
	<li>יש להשיג את הפלסמיד באמצעות ערכת מיני פלסמיד DNA (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>דמיינו את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%.</li>
</ol>

שיבוט הגן PRRSV באורך מלא בווקטור הביטוי pVAX1

<ol>
	<li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning.">Molecular cloning.</a> Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).</li><li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts.">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Horton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+recombination+and+mutagenesis.+SOEing+together+tailor-made+genes.">PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes.</a> Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).</li><li>Bang, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+synthesis+by+circular+assembly+amplification.">Gene synthesis by circular assembly amplification.</a> Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).</li><li>Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+fusion:+a+rapid+and+efficient+method+for+simultaneous+fusion+and+cloning+of+multiple+PCR+products.">USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e55 (2007).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Cho, J. G., Dee, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus.">Porcine reproductive and respiratory syndrome virus.</a> Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).</li><li>Holtkamp, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+on+United+States+pork+producers.">Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers.</a> J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).</li><li>Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+economic+effects+of+vaccination+against+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome:+Impact+of+vaccination+effectiveness,+vaccine+price,+and+vaccination+coverage.">Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage.</a> Front Vet Sci. 7, 500 (2020).</li><li>Dwivedi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immune+responses+to+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+pigs+during+early+stage+of+infection+under+farm+conditions.">Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions.</a> Virol J. 9, 45 (2012).</li><li>Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+consequences+of+exposing+pregnant+gilts+to+strains+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+(PRRS)+virus+isolated+from+field+cases+of+&amp;#34;atypical&amp;#34+PRRS.">Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of &amp;#34;atypical&amp;#34 PRRS.</a> Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).</li><li>Dee, S. A., Joo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+the+spread+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+endemically+infected+pig+herds+by+nursery+depopulation.">Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation.</a> Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).</li><li>Dee, S. A., Joo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+control+PRRS:+a+summary+of+field+and+research+experiences.">Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences.</a> Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).</li><li>Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+vaccines:+Current+status+and+future+direction.">Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction.</a> Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).</li><li>Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus,+a+member+of+the+arterivirus+group.">Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group.</a> Virology. 193 (1), 329-339 (1993).</li><li>Han, M. Y., Yoo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+PRRS+virus+genome:+Updates+and+perspectives.">Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives.</a> Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).</li><li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlap+extension+PCR+cloning:+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids.">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction-based+multiple-fragment+assembly+strategy+to+avoid+random+mutation+during+long+cDNA+cloning.">Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning.</a> J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).</li><li>Zhang, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+outbreak+in+four+Chinese+farms:+Based+on+cost+and+revenue+analysis.">The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis.</a> Front Vet Sci. 9, 1024720 (2022).</li><li>Chen, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+genetic+diversity+of+Chinese+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+viruses+from+2016+to+2019.">High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019.</a> Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).</li><li>Wang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside,+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata,+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1/p53/Drp1+signaling.">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2023).</li><li>Zhang, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+infectious+clone+of+HuN4-F112,+an+attenuated+live+vaccine+strain+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+high+copy+plasmid.">Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid.</a> Virol J. 8, 410 (2011).</li><li>Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+DNA-launched+infectious+clone+for+a+highly+pneumovirulent+strain+of+type+2+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus:+identification+and+in+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+large+spontaneous+deletion+in+the+nsp2+region.">Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region.</a> Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

טכניקת ההרכבה של גיבסון (באנגלית: Gibson assembly technique) היא שיטת שיבוט מולקולרי מבוססת רקומבינציה חוץ גופית להרכבת מקטעי DNA8. שיטה זו מאפשרת הרכבה של מקטעי דנ"א מרובים לפלסמיד מעגלי בתגובה איזותרמית של צינור יחיד. עם זאת, אחד המכשולים לטכניקת הרכבת גיבסון הוא רכישת מקטעים ארוכים ...

כטכניקה חיונית לבניית כלים ניסיוניים מבוססי דנ"א לביטוי בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים, שיבוט מולקולרי הוא מרכיב חשוב מאוד בביולוגיה הניסויית. שיבוט מולקולרי כרוך בארבעה תהליכים: רכישת DNA מוחדר, קשירת האינסרט לווקטור המתאים, טרנספורמציה של הווקטור הרקומביננטי ל- Escherichia coli (E. coli), וזיהוי השיבוטים החיוביים1. עד כה אומצו שיטות רבות לצירוף מולקולות DNA באמצעות אנזימי הגבלה 2,3 ורקומבינציה בתיווך PCR 4,5,6. רקומבינציה הומולוגית, הידועה בשם טכנולוגיית שיבוט חלק, היא קבוצת שיטות שיבוט, המאפשרת החדרה בלתי תלויה ברצף וללא צלקת של מקטע DNA אחד או יותר לתוך וקטור. טכנולוגיה זו כוללת שיבוט בלתי תלוי ברצף וקשירה (SLIC), תמצית שיבוט קשירה חלקה (SLiCE), In-Fusion והרכבת גיבסון. הוא משתמש באקסונוקלאז כדי לפרק גדיל אחד של האינסרט ובווקטור כדי ליצור קצוות מלוכדים, או תיקון in vivo או רקומבינציה במבחנה כדי לצרף באופן קוולנטי את התוספת לווקטור על ידי יצירת קשרי פוספודיסטר. היכולת לחבר תוספת בודדת לווקטור בכל רצף ללא צלקות מושכת מאוד. יתר על כן, לטכנולוגיה יש את היכולת לחבר 5-10 שברים בסדר קבוע מראש ללא מגבלות רצף.
כאחת מטכניקות דנ"א רקומביננטיות רבות, טכניקת הרכבת גיבסון, כיום שיטת השיבוטהיעילה ביותר 7,8, היא שיטה חזקה ואלגנטית מבוססת אקסונוקלאז להרכבת מקטע DNA ליניארי אחד או יותר בצורה חלקה. תגובת הרכבת גיבסון מבוצעת בתנאים איזותרמיים באמצעות תערובת של שלושה אנזימים, כלומר אקסונוקלאז 5', פולימראז בנאמנות גבוהה וליגאז DNA תרמויציב. תעלות חד-גדיליות 3' שנוצרו על ידי אקסונוקלאז 5'-3' תורמות לחישול של שברים בעלי משלימות בקצה אחד. הפולימראז בעל הנאמנות הגבוהה ממלא ביעילות את הפערים באזורים החד-גדיליים המחושלים על ידי הוספת dNTPs, וליגאז הדנ"א התרמו-יציב אוטם את הניקים ליצירת מולקולות DNA משותפות8. לפיכך, שיטה טכנית זו כבר בשימוש נרחב לבניית וקטורים ביטוי גנים.
תסמונת הרבייה והנשימה של חזירים (PRRS) היא מחלה נגיפית המובילה לפגיעה במערכת הרבייה וכשל נשימתי בחזירים הנגרמת על ידי PRRSV בכל גיל9. התסמונת מתבטאת בחום, אנורקסיה, דלקת ריאות, עייפות, דיכאון ומצוקה נשימתית. יתר על כן, סימנים קליניים, כולל שינוי צבע אדום / כחול של האוזניים, נצפו בכמה מגיפות. כחבר בנגיף העורקים המשפחתי, PRRSV מועבר באופן נרחב למדינות המייצרות בשר חזיר על ידי מגע ישיר והחלפת נוזלים, כולל שתן, קולוסטרום ורוק. בשל התפשטות PRRSV בארצות הברית, סך ההפסדים הכלכליים של תעשיית בשר החזיר הוערך בכ -664 מיליון דולר בשנה, בהתבסס על היקף הרבייה של 5.8 מיליון זורעים ו -110 מיליון חזירים 10,11. דו"ח השירות לפיקוח על בריאות בעלי חיים וצמחים מראה כי 49.8% מהחזירים הלא מחוסנים מראים נוכחות של PRRSV בסרום12 ורמות נמוכות של PRRSV בחזירים נגועים מופרשות דרך רוק, הפרשות מהאף, שתן וצואה13. אסטרטגיות מרובות יושמו כדי לשלוט בהתפשטות PRRSV 14,15,16. בנוסף להליכי חיסול ליצירת אוכלוסיות שליליות לחלוטין לנגיף או שיפור הבטיחות הביולוגית והניהול, מתן חיסונים הוא אמצעי יעיל לשליטה ב- PRRS.
PRRSV הוא נגיף RNA עטוף, חד-גדילי, בעל חוש חיובי באורך של כ-15 קילו-בסיסים (kb). גנום PRRSV מורכב מלפחות 10 מסגרות קריאה פתוחות (ORFs), אזור קצר 5' לא מתורגם (5' UTR), וזנב פולי(A) במסוף 3' (איור 1A)17. הגנום של נגיף RNA בעל גדיל שלילי אינו מדבק ואילו הגנום של נגיפי RNA בעלי גדיל חיובי הוא מדבק. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות עבור RNA ו DNA transfection ליצירת צאצאים וירוס18. עם זאת, שיבוט המקטע באורך מלא המתאים לגנום הרנ"א הוא חיוני לבניית שיבוטים זיהומיים. בשל אופיו הארוך והמורכב של גנום PRRSV, לא ניתן להשיג בקלות את הגנום באורך מלא באמצעות PCR בבת אחת. בנוסף, למרות שהסינתזה המלאכותית של גנים PRRSV היא פתרון יעיל, סינתזה של מקטעים ארוכים היא לעתים קרובות יקרה. לפיכך, כדי לקבל את וקטור הביטוי באורך מלא PRRSV, ניסינו ליצור אותו על ידי שיטת הרקומבינציה ההומולוגית19,20 של הוספות מרובות. למרבה הצער, לא הצלחנו להשיג את וקטור ביטוי הגנים באורך מלא. לכן, במחקר זה, הוספנו אתרי הגבלה מתאימים לפריימר ההפוך והשגנו בהצלחה את וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי מספר סבבים של תגובות רקומבינציה הומולוגיות. יתר על כן, שיטה זו יכולה גם להשיג מחיקה או מוטציה של גני המטרה ולצרף ביעילות מספר רב של מקטעי DNA לווקטור הביטוי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb plus DNA Ladder</td>
			<td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td>
			<td>MD113-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Universal Green PCR Master Mix</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A303-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FRESCO17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Sujing Antai Air Technology&#160; Co., Ltd</td>
			<td>VD-650-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Electrophoresis Equipment</td>
			<td>Cleaver Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>170905117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Buffer (6x)</td>
			<td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>BL532A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Z. N. A. Gel Extraction kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td>
			<td>D2500-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td>
			<td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td>
			<td>D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating Standing-temperature Cultivator</td>
			<td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHP-9082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A101-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExonScript RT SuperMix with dsDNase</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest HindIII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest NheI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest NotI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc XR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td>
			<td>721BR07925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goldview Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>YB10201ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Maker Machine</td>
			<td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td>
			<td>FMB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>12361010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plate (Kanamycin)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B530113-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB sterile liquid medium (Kanamycin)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B540113-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td>
			<td>NN-GM333W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td>
			<td>ZHWY-2102C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRRSV virus</td>
			<td>Sichuan Agricultural University</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene</td>
			<td>GSL Biotech, LLC</td>
			<td>v5.1</td>
			<td>To design primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories&#160; Co., Ltd</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B040123-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seamless cloning approach for porcine reproductive and respiratory syndrome virus expression vector construction

בניית וקטורים של ביטוי גנים היא מרכיב חשוב בעבודת מעבדה בביולוגיה ניסויית. עם פיתוחים טכניים כמו Gibson Assembly, הבנייה הווקטורית הופכת לפשוטה ויעילה יחסית. עם זאת, כאשר הגנום באורך מלא של וירוס הרבייה והנשימה החזירי (PRRSV) אינו יכול להיות מוגבר בקלות על ידי תגובת שרשרת פולימראז יחידה (PCR) מ- cDNA, או שקשה לרכוש וקטור ביטוי גנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית של תוספות מרובות במבחנה, טכניקת הרכבת גיבסון הנוכחית אינה מצליחה להשיג מטרה זו.
כתוצאה מכך, מטרתנו הייתה לחלק את גנום PRRSV למספר מקטעים ולהכניס אתרי הגבלה מתאימים לתוך הפריימר ההפוך לקבלת מקטעים מוגברים PCR. לאחר חיבור מקטע הדנ"א הקודם לווקטור על ידי טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית, הווקטור החדש רכש את אתר המחשוף של אנזים ההגבלה. לפיכך, אנו יכולים ליצור ליניאריזציה של הווקטור באמצעות אתר מחשוף האנזים החדש שנוסף ולהציג את מקטע הדנ"א הבא במורד הזרם של מקטע הדנ"א במעלה הזרם.
אתר המחשוף של אנזים ההגבלה שהוכנס בקצה 3' של מקטע הדנ"א במעלה הזרם יבוטל, ואתר מחשוף חדש יוכנס לקצה 3' של מקטע הדנ"א במורד הזרם. בדרך זו אנו יכולים לחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה. שיטה זו ישימה לבנייה מוצלחת של וקטור ביטוי PRRSV והיא שיטה יעילה להרכבת מספר רב של שברים לווקטור הביטוי.

As an essential technique to construct DNA-based experimental tools for expression in prokaryotic and eukaryotic cells, molecular cloning is a very important component of experimental biology. Molecular cloning involves four processes: the acquisition of insert DNA, ligation of the insert into the appropriate vector, transformation of the recombinant vector into Escherichia coli (E. coli), and identification of the positive clones1. So far, multiple methods have been adopted for joining DNA molecules by using restriction enzymes2,3 and PCR-mediated recombination4,5,6. Homologous recombination, known as seamless cloning technology, is the group of cloning methods, which allows sequence-independent and scarless insertion of one or more fragments of DNA into a vector. This technology includes sequence- and ligation-independent cloning (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion, and Gibson Assembly. It employs an exonuclease to degrade one strand of the insert and a vector to generate cohesive ends, and either in vivo repair or in vitro recombination to covalently join the insert to the vector by forming phosphodiester bonds. The ability to join a single insert to a vector at any sequence without any scars is very appealing. Furthermore, the technology has the ability to join 5-10 fragments in a predetermined order without sequence restrictions.
As one of many recombinant DNA techniques, the Gibson Assembly technique, currently the most effective cloning method7,8, is a robust and elegant exonuclease-based method to assemble one or multiple linearized DNA fragments seamlessly. The Gibson Assembly reaction is performed under isothermal conditions using a mixture of three enzymes,namely, 5&#39; exonuclease, high-fidelity polymerase, and a thermostable DNA ligase. Single-strand 3&#180; overhangs created by the 5&#39;-3&#39; exonuclease contribute to the annealing of fragments that share complementarity at one end. The high-fidelity polymerase effectively fills the gaps in the annealed single-strand regions by adding dNTPs, and the thermostable DNA ligase seals the nicks to form joint DNA molecules8. Hence, this technical method has been widely used for the construction of gene expression vectors.
Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a viral disease that leads to reproductive impairment and respiratory failure in pigs caused by PRRSV at any age9. The syndrome is manifested as fever, anorexia, pneumonia, lethargy, depression, and respiratory distress. Moreover, clinical signs, including red/blue discoloration of the ears, have been observed in some epidemics. As a member of the family arterivirus, PRRSV is widely transmitted to pork-producing countries by direct contact and exchange of fluids, including urine, colostrum, and saliva. Due to the spread of PRRSV in the United States, the total economic losses of the pork industry have been estimated to be approximately $664 million per year, based on the breeding scale of 5.8 million sows and 110 million pigs10,11. The Animal and Plant Health Inspection Service report shows that 49.8% of unvaccinated pigs show the presence of PRRSV in serum12 and low levels of PRRSV in infected pigs are excreted through saliva, nasal secretions, urine, and feces13. Multiple strategies have been implemented to control PRRSV propagation14,15,16. In addition to elimination procedures to create completely virus-negative populations or improving biosafety and management, administering vaccines is an effective means of controlling PRRS.
PRRSV is an enveloped, single-stranded, positive-sense RNA virus with a length of approximately 15 kilobases (kb). The PRRSV genome consists of at least 10 open reading frames (ORFs), a short 5&#39; untranslated region (5&#39; UTR), and a poly(A) tail at the 3&#39; terminus (Figure 1A)17. The genome of a negative-stranded RNA virus is non-infectious whereas the genome from positive-stranded RNA viruses is infectious. There are two main strategies for RNA and DNA transfection for generating virus progeny18. However, cloning the full-length fragment corresponding to the RNA genome is crucial for the construction of infectious clones. Due to the long and complex nature of the PRRSV genome, the full-length genome cannot be easily obtained through PCR at once. Additionally, although the artificial synthesis of PRRSV genes is an effective solution, the synthesis of long fragments is often expensive. Hence, to obtain the PRRSV full-length expression vector, we attempted to create it by the multiple inserts homologous recombination method19,20. Unfortunately, we were not able to obtain the full-length gene expression vector. Therefore, in this study, we added appropriate restriction sites to the reverse primer and successfully obtained the pVAX1-PRRSV expression vector by several rounds of homologous recombination reactions. Furthermore, this method can also achieve deletion or mutation of target genes and efficiently join a large number of DNA fragments to the expression vector.

מחבר זרקור: חקר טכניקות שיבוט עבור מקטעי DNA באורך מלא

גישת שיבוט חלקה לבנייה וקטורית של ביטוי וירוסים ברבייה חזירית ובתסמונת הנשימה

This protocol demonstrates the construction of a lengthy and intricate gene expression vector. When a full-length DNA fragment cannot be obtained by a single PCR from cDNA, or the full-length gene expression vector cannot be obtained by multiple-insert homologous recombination in vitro, this method is applicable. Currently, multiple-insert ligation cloning is used to obtain full-length DNA fragment for cloning into a suitable vector.This method can achieve deletion or mutation of target genes and efficiently join a large number of DNA fragments to the expression vector.

במאמר זה אנו מציגים מערכת רקומבינציה במבחנה להרכבה ותיקון של מולקולות דנ"א חופפות באמצעות פריימר הפוך באמצעות אתרי הגבלה שמוצגים ללא הרף (איור 1B). מערכת זו היא הליך פשוט ויעיל הכולל את הכנת הווקטור הליניארי ואת קטעי ההוספה המכילים שלוחות שהוכנסו על ידי PCR עם פריימרים ב...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי הצגת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. אנו יכולים להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית.

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

פרוטוקול זה מדגים בנייה של וקטור ביטוי גנים ארוך ומורכב. כאשר לא ניתן להשיג מקטע DNA באורך מלא על ידי PCR יחיד מ- cDNA, או שלא ניתן להשיג את וקטור ביטוי הגנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית מרובת כניסות במבחנה, שיטה זו ישימה. כיום, שיבוט קשירה מרובת כניסות משמש להשגת מקטע DNA באורך מלא לשיבוט לווקטור מתאים.שיטה זו יכולה להשיג מחיקה או מוטציה של גני מטרה ולצרף ביעילות מספר רב של מקטעי DNA לווקטור הביטוי.

a-seamless-cloning-approach-for-porcine-reproductive-respiratory

Research

JoVE Journal

Biology

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

347 Views.  China West Normal University. פרוטוקול זה מדגים בנייה של וקטור ביטוי גנים ארוך ומורכב. כאשר לא ניתן להשיג מקטע DNA באורך מלא על ידי PCR יחיד מ- cDNA, או שלא ניתן להשיג את וקטור ביטוי הגנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית מרובת כניסות במבחנה, שיטה זו ישימה. כיום, שיבוט קשירה מרובת כניסות משמש להשגת מקטע DNA ?...

Video: מחבר זרקור: חקר טכניקות שיבוט עבור מקטעי DNA באורך מלא

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson Assembly, vector construction becomes relatively simple and efficient. However, when the full-length genome of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) cannot be easily amplified by a single polymerase chain reaction (PCR) from cDNA, or it is difficult to acquire a full-length gene expression vector by homologous recombination of multiple inserts in vitro, the current Gibson Assembly technique fails to achieve this goal.
Consequently, we aimed to divide the PRRSV genome into several fragments and introduce appropriate restriction sites into the reverse primer for obtaining PCR-amplified fragments. After joining the previous DNA fragment into the vector by homologous recombination technology, the new vector acquired the restriction enzyme cleavage site. Thus, we can linearize the vector by using the newly added enzyme cleavage site and introduce the next DNA fragment downstream of the upstream DNA fragment.
The introduced restriction enzyme cleavage site at the 3&#39; end of the upstream DNA fragment will be eliminated, and a new cleavage site will be introduced into the 3&#39; end of the downstream DNA fragment. In this way, we can join DNA fragments to the vector one by one. This method is applicable to successfully construct the PRRSV expression vector and is an effective method for assembling a large number of fragments into the expression vector.

Here, we present a protocol to obtain the pVAX1-PRRSV expression vector by introducing suitable restriction sites at the 3' end of the inserts. We can linearize the vector and join DNA fragments to the vector one by one through homologous recombination technology.

PCR Primer Design for Cloning of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Gene

To begin, open the software and select the option to create a new DNA file. Prepare the PRRSV gene sequence from NCBI and click Okay to generate the sequence files. Analyze the sequence and mark the fragment junctions.Identify all the junctions before designing the specific sequence primers for the fragments. Then click on Primers and choose Add Primer. Paste the specific sequence and add overlap sequences of the vector to the first five prime nucleotide of the primer.Name the forward primer and click on Add Primer to Template to incorporate the designed primer into the template. Then mark the fragment junctions and design the reverse specific sequence primer of the fragments. Again, navigate to Primers and select Add Primer.Input the specific sequence. Add the restriction site to the first five prime nucleotide. Also, include 20 to 40 base pairs of vector overhang sequences to the first five prime nucleotide of the restriction site.Name the reverse primer and select Add Primer to Template. Next, set up six individual PCR reactions using the six fragments and designed primer pairs. Run the PCR following a three-step protocol as shown here.After PCR completion, pipette one microliter of six xDNA loading buffer with five microliters of the PCR product. Mix and centrifuge briefly. Analyze the samples using 1%agarose gel electrophoresis.To construct a full length gene, insert fragments of PRRSV were amplified using six PCR reactions. The sizes of the fragments were confirmed by agarose gel electrophoresis.

תכנון פריימר PCR לשיבוט הגן של נגיף הרבייה והנשימה החזירית

Cloning of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Gene into the pVAX1 Vector

Begin by linearizing the vector. Prepare the reaction mixture containing specific restriction enzymes at room temperature. Use a gel extraction kit to purify the linearized vectors, then incubate a 37 degrees Celsius for 60 minutes.Then, assemble the exon R seamless cloning and assembly reaction to sub-clone the PRRSV gene. Adjust the total reaction volume to 10 microliters with sterilized deionized water. Then, thoroughly mix.Incubate the mixture in a thermocycler for 15 to 60 minutes at 50 degrees Celsius. Afterwards, store the samples on ice. After transforming the vector into competent cells, pick eight colonies into 20 microliters of LB medium containing kanamycin.Set up a colony PCR reaction to analyze the transformants. A full length PRRSV over-expression vector was obtained by introducing PRRSV fragment one into the pVAX1 vector, creating pVAX1-F1. Successive rounds of recombination using specific restriction enzymes resulted in incorporation of fragments two through five, visualized by an increase in plasmid size.