על מנת לפתח תרופות חדשניות ותרכובות כי היעד גידולים במערכת העצבים המרכזית, הנגישות ומעבר דרך מחסום הדם - מוח חשוב מאוד. למרות הציטוקסיות של התרכובות ניתן למדוד בקלות על ידי דגירה התאים עם מולקולות טיפוליות, זה לא ממש אומר שום דבר על המסירה בפועל לאתר הגידול במוח. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו את הפרוטוקול הבא המתאר כיצד לשחזר את מחסום הגידול בדם - מוח במבחנה על צלחת.
השימוש בתאים מונצחים ממוצא מורין או אנושי הופך את ההסתה הזו לגמישה מאוד. זה יכול גם להיות קנה מידה בקלות עד המסך עשרות תרכובות עם רבייה גבוהה. בנוסף, שיטה זו מאפשרת הן כימות והן הדמיה של המעבר ויכולת המיקוד של התרכובות לפני שתמשיך במודלים פרה-קליניים.
לכן, השיטה שלנו מחליפה חלקית את המודלים של בעלי החיים באמצעות קווי התאים שנקבעו מראש. הכללת תאים סרטניים במוח שמקורם בחולה תוודא את ההטרוגניות של המטופל, בעוד שהשימוש בתאים מונצחים כדי להקים את מחסום הדם - מוח מבטיח את הרבייה של התוצאות. בסך הכל, מודל מחסום הדם - מוח הזה מציע כלי מעניין באמת כדי להתוות את דיפוזיה התרופה או משלוח של כלי רכב סמים.
הדגמה חזותית של השיטה היא קריטית מכיוון שזרע של התאים בצד הנגדי של ההוספה דורש מניפולציה שלא מתוארת לעתים קרובות בפרוטוקולים אחרים באמצעות התקנה דומה. לדוגמה, קבלת הידבקות של אסטרוציטים כאשר הכנס ממוקם במהופך יתרונות גבוהים מייצוג חזותי. מתחת למכסה המנוע של תרבות התאים הסטריליים, שטפו בזהירות את האסטרוציטים התרבותיים עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי.
השתמש במשאבת ואקום כדי להשליך בעדינות את ה- PBS, ולהוסיף שני מיליליטר של ניתוק תאים במשך חמש דקות כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של בינוני תרבות תאי אסטרוציטים מלאה סטרילית לכלי כדי לעכב את הפעילות של reagent דיסוציאציה התא. השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להעביר את התאים מנותקים מהכלי לצינור סטרילי 15 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, תגדיר את התוספים. השתמש במטסים סטריליים כדי למקם את המכניסים עם צד המוח על המכסה של צלחת סטרילית שש בארות.
כאשר הצנטריפוגה הושלמה, בזהירות להשליך את supernatant מן ההשעיה התא, ו resuspend גלולת אסטרוציטים במיליליטר אחד של ABM פלוס על ידי צינור בעדינות את גלולה על הקיר של הצינור עד חמש פעמים. לאחר מכן, ספור את התאים והתאם את צפיפות מתלי התא ל- 150, 000 תאים ב- 400 מיקרוליטרים של ABM פלוס לכל הכנסה. מניחים את ההשעיה של התא באמצע צד המוח של קרום המוסף, ומפזרים אותו בזהירות באמצעות כוח נימי עם קצה פיפטה סטרילי.
כאשר צד המוח של המוסיף עדיין למעלה, מקם את לוח ששת הטובים בחזרה על המוסיף. מניחים את הצלחת ומכניסים, עם צד המוח למעלה, לתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר הידבקות בתא. לאחר מכן, להחזיר את צלחת שש בארות בחזרה למיקום הרגיל שלה, עם מוסיף עכשיו צד הדם למעלה.
הוסף מדיום והמשך את הדגירה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מתחת למכסה המנוע של תאים סטריליים, שטפו בזהירות את תאי האנדרותל התרבותיים עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי. השתמש במשאבת ואקום כדי להשליך בעדינות את ה- PBS, ולהוסיף שני מיליליטר של ניתוק תאים במשך חמש דקות כדי לנתק את התאים.
לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של בינוני תרבות תאים אנדותל מלא סטרילי לכלי כדי לעכב את הפעילות של reagent דיסוציאציה התא. השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להעביר את התאים מנותקים מהכלי לצינור סטרילי 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולתלות מחדש את גלולת התא אנדותל במיליליטר אחד של EBM פלוס על ידי צינורות לאט המתלה התא על הקיר של הצינור עד חמש פעמים. לספור את התאים, ולהתאים את צפיפות המתלים התא ל 200, 000 תאים ב 2.5 מיליליטר של תרבות התא אנדותל נטול סרום וגורם גדילה אנדותל כלי דם-A לכל הכנסה. אחזר את הלוח המכיל את ההוספות.
בזהירות להשליך את המדיום מצד הדם, ולהחליף אותו עם 2.5 מיליליטר של השעיה תא אנדותל. לאחר מכן, להחזיר את הצלחת לחממה, ולהשאיר אותו לילה כדי לאפשר לתאי ה אנדותל לדבוק הממברנה. למחרת, הכינו צלחת של שש בארות על ידי העברת שלושה מיליליטר של ABM-מינוס מחומם מראש לכל באר.
באמצעות מדפים סטריליים, לטפל בתוספות כדי להשליך בזהירות את המדיום השלם אנדותל מצד הדם, ולמקם את הכנס לתוך הלוח החדש המכיל ABM-מינוס. לאחר מכן, להוסיף 2.5 מיליליטר של EBM-מינוס. השאירו את המכניסים באינקובטור עם הפרעה פיזית מינימלית או וריאציית טמפרטורה במשך חמישה ימים.
ביום ההעברה, החלף את המדיום. להדמיית שפעת חיסונית, מניחים עד ארבעה כיסויי בורוזיליקט סטריליים עגולים לתוך כל באר של צלחת שש באר המכילה שני מיליליטר של פולי-D-ליזין. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
בינתיים, השתמש פיפטה סרולוגית סטרילית להעביר בזהירות את כדורי הגידול מכלי תרבות התא לצינור סטרילי 15 מיליליטר. צנטריפוגה כדורי הגידול ב 250 פעמים g במשך שלוש דקות. השלך את העל-טבעי, ולחץ בעדינות על הספירות במיליליטר אחד של GBM-מינוס.
ספור את התאים והתאם את צפיפות התאים לכ- 10, 000 כדורים או 100, 000 תאים למיליליטר של GBM-מינוס. לאחר מכן, השלך את הפולי-D-ליזין מה בארות, ולשטוף את הבאר שלוש פעמים עם PBS סטרילי. זרע כל באר של הצלחת עם שלושה מיליליטר של ההשעיה spheroid הגידול, ולהעביר את המכניסים עם חיקוי BBTB על ההשעיה תא הגידול.
דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני כדי לאפשר את הדם ואת צידי הגידול במוח של ההסטה לבוא שיווי משקל. למחרת, להחליף את התקשורת בצד הדם עם EBM מינוס בתוספת מולקולות, תרופות, או חלקיקים של עניין. לאסוף את הדגימות לאורך זמן לכימות ישיר כפי שתואר קודם לכן.
ראשית, לאסוף 100 microliters של המדיום הן מן הדם ואת צידי המוח של חיקוי BBTB, ולהעביר כל אחד נפרד שטוח תחתית, שחור, 96 גם צלחת עבור מדידות פלואורסצנטיות הבאים. לאחר מכן, להכין פתרון 50 מיקרומולר של נתרן פלואורסצין ב EBM-מינוס, הקפד להכין 2.5 מיליליטר ל הבאר. מחממים מראש את הפתרון הזה ל-37 מעלות צלזיוס, ומחליפים את המדיה מצד הדם של המוסיף במדיה המכילה את פתרון הנתרן הפלואורסין הזה.
התחל שעון זמן ברגע שהמדיום מוחלף. בזהירות לאסוף 100 microliters של מדיה משני הצדדים הדם והמוח של מוסיף בחמש דקות, 30 דקות, 60 דקות, ו 120 דקות. מעבירים כל דגימה ל בארות נפרדות של הצלחת השחורה המתאימה, 96 בארות.
השתמש בקורא לוחות כדי לכמת את הפלואורסצנטיות מהדגימות שנאספו. ראשית, מדללים את הצבע הפלואורסצנטי lysosome לריכוז העבודה המתאים במדיום מחומם מראש. מוסיפים את זה לתאים, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 45 דקות.
לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח. השליכו את ה-PBS, והוסיפו שלושה מיליליטר של פרפורמלדהיד קר כקרח 4% ל בארות ו-2.5 מיליליטר לתוספה. דגירה על קרח במשך 10 דקות.
לאחר מכן, להשליך את paraformaldehyde, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הסר את PBS, ונגד גרעיני התא באמצעות פתרון DAPI בריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר במים מזוקקים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שבע דקות.
לאחר מכן, להסיר את DAPI, ולשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם מים מזוקקים. חותכים בזהירות את הממברנה, מסירים את המים המזוקקים ומ מניחים אותה על טיפת מדיום הרכבה על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. מוסיפים עוד טיפה של מדיום הרכבה בצד השני של הממברנה, ומכסים אותה בזהירות בזכוכית כיסוי בורוסיליקט.
במחקר זה, תאים אנדותל היו מתורבתים במשותף עם אסטרוציטים כדי ליצור מחסום גידול בדם - מוח כמו ממשק במערך במבחנה. הדמיה קונפוקל של חיקוי BBTB מורין מראה את הביטוי ואת לוקליזציה הסלולר של חלבוני צומת הדוק זונולה occludens-1 ו קלודין-5 ב bEND3. מגעים בין תאי האנדותל לאסטרוציטים גורמים בבירור להעברתם של שני חלבונים אלה למגעים אנדותל מתא לתא בהשוואה למונוקולטורות bEND3.
באמצעות כתמי immunofluorescence כדי לדמיין את האסטרוציטים המביעים GFAP בצד המוח של הממברנה, ניתן להתבונן וללמוד את התהליכים האסטרוציטיים ואת רגלי הקצה ליצירת קשר עם תאי ה אנדותל דרך הממברנה. כדי להשוות את ערכי החדירה של חיקוי BBTB במבחנה עם מחסום הדם - מוח במבחנה, דיפוזיה בזמן אמת של נתרן פלואורסין הוא בתמונה דרך חלון גולגולת מושתל בעכברים עירומים. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי, דיפוזיה פלואורסין נתרן מן נימי כלי הדם הנובעים כלי הדם pial הראשי נרשם לפני, במהלך, ולאחר הזרקה מערכתית של החללית.
טרנסציטוזיס של חלקיקים כי היעד כדורי גליובלסטומה שמקורם בחולה מושווה לאחר מכן כדי להמחיש כיצד זה חיקוי BBTB יכול לשמש כדי לדמיין את המעבר של תרכובות מצד הדם לצד המוח. אות הפלואורסצנט המשויך ל- NP110 מסמן במשותף עם הליזומים בתאי ה אנדותל, אסטרוציטים ותאי גידול. בנוסף, NP110s מזוהים בין תאי אנדותל ואסטרוציטים, עובר דרך נקבוביות הממברנה של הכנס.
המעבר של NP110s הוא לכמת על ידי מדידת הפלואורסצנטיות מדגימות שנאספו הן בצד הדם והן בצד המוח, וערכים אלה מושווים אלה חלקיקים נחושים כי הם 350 ננומטר. כפי שניתן לראות, רק NP110s מסוגלים לחצות את חיקויי BBTB, בעוד NP350 נשאר בצד הדם, וכתוצאה מכך ערכי חברות נמוכים יותר עבור חלקיקים אלה. לטפל להוסיף בזהירות, בזהירות להפיץ את ההשעיה תא אסטרוציטים בצד המוח של הכנס ללא מגע ישיר של הממברנה.
כל נזק של הממברנה יגרום לדליפה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לענות על השאלה של אספקת המוח של מטענים מנוהלים היקפיים. באמצעות תוספות שונות עם נקבוביות ממברנה גדולות יותר, ניתן גם ללמוד פזרנות תאים.
טכניקה זו ניתן לשנות באמצעות סוגי תאים שונים כדי לחקות מחסומים תאיים אחרים. זה גם סולל את הדרך למחקר אחראי ואתי יותר, שמטרתו להפחית את מספר חיות המעבדה המשמשות לאימות תרופות נגד סרטן. אנא זכרו כי paraformaldehyde הוא כימיקל רעיל מאוד ויש לטפל בו בהתאם.
כמו כן, היזהר בעת שימוש אזמל חד כדי לחלץ את הממברנות מן מוסיף.
