Prédiction en prestation de charges utiles Vivo à l’aide d’une barrière hémato-encéphalique tumeur dans un plat

Afin de développer de nouveaux médicaments et composés qui ciblent les tumeurs dans le système nerveux central, l’accessibilité et le passage à travers la barrière céphalo-cérébrale est très important. Bien que la cytotoxicité des composés peut facilement être mesurée en incubant les cellules avec les molécules thérapeutiques, il ne dit pas vraiment quoi que ce soit sur la livraison réelle au site tumoral dans le cerveau. Pour résoudre ce problème, nous avons développé le protocole suivant qui décrit comment recréer la barrière tumorale sang-cerveau in vitro sur un plat.

L’utilisation de cellules immortalisées d’origine murine ou humaine rend cet essai très flexible. Il peut également être facilement mis à l’échelle jusqu’à l’écran des dizaines de composés avec une reproduisabilité élevée. En outre, cette méthode permet à la fois la quantification et la visualisation du passage et la capacité de ciblage des composés avant de procéder à des modèles précliniques.

Par conséquent, notre méthode remplace partiellement les modèles animaux en utilisant les lignées cellulaires préé établies. L’inclusion des cellules de tumeur de cerveau patient-dérivées analyse l’hétérogénéité patiente, alors que l’utilisation des cellules immortalisées pour établir la barrière hé cerveau-encéphalique assure la reproductibilité des résultats. Au total, ce modèle de barrière céphalo-encéphalique offre un outil vraiment intéressant pour faire le point sur la diffusion des médicaments ou la livraison de véhicules de drogue.

La démonstration visuelle de la méthode est essentielle parce que l’ensemencement des cellules de l’autre côté de l’insert nécessite une manipulation qui n’est pas souvent décrite dans d’autres protocoles à l’aide d’une configuration similaire. Par exemple, l’obtention de l’adhérence des astrocytes lorsque l’insert est placé à l’envers bénéficie fortement de la représentation visuelle. Sous un capot stérile de culture cellulaire, lavez soigneusement les astrocytes cultivés avec cinq millilitres de PBS stérile.

Utilisez une pompe à vide pour jeter doucement le PBS, et ajouter deux millilitres de réaccente de dissociation cellulaire pendant cinq minutes pour détacher les cellules. Ensuite, ajouter 10 millilitres de milieu stérile de culture cellulaire complète des astrocytes au vaisseau pour inhiber l’activité du réaccente de dissociation cellulaire. Utilisez une pipette sérologique stérile pour transférer les cellules détachées du vaisseau vers un tube stérile de 15 millilitres.

Centrifugeuse à 250 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Pendant ce temps, définissez les inserts. Utilisez des forceps stériles pour placer les inserts avec le côté cérébral vers le haut sur le couvercle d’une plaque stérile de six puits.

Lorsque la centrifugation est terminée, jetez soigneusement le supernatant de la suspension cellulaire, et resuspendez la pastille d’astrocyte dans un millilitre d’ABM-plus en pipetting doucement la pastille sur le mur du tube jusqu’à cinq fois. Ensuite, comptez les cellules, et ajustez la densité de suspension cellulaire à 150 000 cellules dans 400 microlitres d’ABM-plus par insert. Placez la suspension cellulaire au milieu du côté cérébral de la membrane de l’insert, et étalez-la soigneusement à l’aide d’une force capillaire avec une pointe stérile de pipette.

Avec le côté cerveau des inserts encore en place, placez la plaque de six puits sur les inserts. Placez la plaque et les inserts, avec le côté cerveau vers le haut, dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour permettre l’adhérence cellulaire. Après cela, revenir la plaque de six puits de retour à sa position régulière, avec les inserts maintenant côté sang vers le haut.

Ajouter moyen, et continuer l’incubation comme décrit dans le protocole de texte. Sous un capot stérile de culture cellulaire, lavez soigneusement les cellules endothéliales de culture avec cinq millilitres de PBS stérile. Utilisez une pompe à vide pour jeter doucement le PBS, et ajouter deux millilitres de réaccente de dissociation cellulaire pendant cinq minutes pour détacher les cellules.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu stérile complet de culture cellulaire endothéliale au vaisseau pour inhiber l’activité du réaccente de dissociation cellulaire. Utilisez une pipette sérologique stérile pour transférer les cellules détachées du vaisseau vers un tube stérile de 15 millilitres. Centrifugeuse à 250 fois g pendant trois minutes à température ambiante.

Après cela, jetez le supernatant, et resuspendez la pastille de cellules endothéliales dans un millilitre d’EBM-plus en pipetting lentement la suspension de cellules sur le mur du tube jusqu’à cinq fois. Comptez les cellules, et ajustez la densité de suspension cellulaire à 200 000 cellules dans 2,5 millilitres de culture cellulaire endothéliale dépourvue de sérum et de facteur de croissance endothéliale vasculaire A par insert. Récupérer la plaque contenant les inserts.

Jetez soigneusement le milieu du côté sanguin et remplacez-le par les 2,5 millilitres de suspension cellulaire endothéliale. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur et laissez-la toute la nuit pour permettre aux cellules endothéliales d’adhérer à la membrane. Le lendemain, préparez une assiette de six puits en transférant trois millilitres d’ABM-moins préchauffé à chaque puits.

À l’aide de forceps stériles, manipuler les inserts pour jeter soigneusement le milieu complet endothélial du côté sanguin, et placer l’insert dans la nouvelle plaque contenant ABM-moins. Ajouter ensuite 2,5 millilitres d’EBM-moins. Laissez les inserts dans l’incubateur avec un minimum de perturbation physique ou de variation de température pendant cinq jours.

Le jour du transfert, remplacer le support. Pour l’imagerie par immunofluorescence, placez jusqu’à quatre couvertures stériles rondes de borosilicate dans chaque puits d’une plaque de six puits contenant deux millilitres de poly-D-lysine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Pendant ce temps, utilisez une pipette sérologique stérile pour transférer soigneusement les sphères tumorales du vaisseau de culture cellulaire à un tube stérile de 15 millilitres. Centrifugeuse les sphères tumorales à 250 fois g pendant trois minutes. Jetez le supernatant et resuspendez doucement les sphères en un millilitre de GBM-moins.

Comptez les cellules, et ajustez la densité cellulaire à environ 10 000 sphères ou 100 000 cellules par millilitre de GBM-moins. Ensuite, jetez la poly-D-lysine des puits et rincez les puits trois fois avec du PBS stérile. Ensemencer chaque puits de la plaque avec trois millilitres de la suspension sphéroïde tumorale, et transférer les inserts avec l’imitation BBTB sur la suspension cellulaire tumorale.

Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pour permettre aux côtés du sang et des tumeurs cérébrales de l’essai d’atteindre l’équilibre. Le lendemain, remplacez les médias du côté sanguin par des EBM-moins complétés par les molécules, les médicaments ou les nanoparticules d’intérêt. Recueillir les échantillons au fil du temps pour une quantification directe comme décrit précédemment.

Tout d’abord, recueillir 100 microlitres du milieu à la fois du sang et les côtés du cerveau de la BBTB imiter, et transférer chacun à un fond plat séparé, noir, plaque de 96 puits pour les mesures de fluorescence ultérieures. Ensuite, préparez une solution de 50 micromolaires de fluorescéine de sodium dans EBM-moins, en vous assurant de préparer 2,5 millilitres par puits. Préchauffer cette solution à 37 degrés Celsius, et remplacer les médias du côté sanguin des inserts par des supports contenant cette solution de fluorescéine de sodium.

Démarrez une insurrateur dès que le support est remplacé. Recueillir soigneusement 100 microlitres de médias à la fois du sang et du cerveau des inserts à cinq minutes, 30 minutes, 60 minutes et 120 minutes. Transférer chaque échantillon dans des puits séparés de la plaque noire appropriée de 96 puits.

Utilisez un lecteur de plaques pour quantifier la fluorescence des échantillons prélevés. Tout d’abord, diluer le colorant fluorescent lysosome à la concentration de travail appropriée dans le milieu préchauffé. Ajoutez ceci aux cellules, et incubez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 45 minutes.

Rincez ensuite les cellules trois fois avec du PBS glacé. Jetez le PBS et ajoutez trois millilitres de paraformaldéhyde glacé de 4 % aux puits et de 2,5 millilitres à l’insert. Incuber sur la glace pendant 10 minutes.

Après cela, jeter le paraformaldéhyde, et rincer les cellules trois fois avec PBS. Retirez le PBS et contre-entacher les noyaux cellulaires à l’aide d’une solution DAPI à une concentration finale d’un microgramme par millilitre dans de l’eau distillée. Incuber à température ambiante pendant sept minutes.

Ensuite, retirez le DAPI et lavez les membranes trois fois avec de l’eau distillée. Coupez soigneusement la membrane, retirez l’eau distillée et placez-la sur une goutte de milieu de montage sur une lame de microscope en verre. Ajouter une autre goutte de milieu de montage de l’autre côté de la membrane, et le couvrir soigneusement avec un verre de couverture borosilicate.

Dans cette étude, les cellules endothéliales ont été co-cultivés avec des astrocytes pour former une interface de barrière-comme de tumeur de sang-cerveau dans une configuration in vitro. L’imagerie confocale de l’imitation de BBTB murine montre l’expression et la localisation cellulaire des protéines de jonction serrées zonula occludens-1 et claudin-5 dans bEND3. Les contacts entre les cellules endothéliales et les astrocytes induit clairement la relocalisation de ces deux protéines vers les contacts endothéliales cellule à cellule par rapport aux monocultures bEND3.

À l’aide de taches d’immunofluorescence pour visualiser les astrocytes exprimant le GFAP du côté cérébral de la membrane, il est possible d’observer et d’étudier les processus astrocytiques et les pieds finaux en contactant les cellules endothéliales à travers la membrane. Pour comparer les valeurs de perméabilité du BBTB in vitro imite avec la barrière in vitro de sang-cerveau, la diffusion en temps réel de fluorescéine de sodium est image par une fenêtre crânienne implantée chez les souris nues. À l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence, la diffusion de fluorescéine de sodium à partir des capillaires des vaisseaux sanguins provenant des principaux vaisseaux sanguins piaux est enregistrée avant, pendant et après l’injection systémique de la sonde.

La transcytose des nanoparticules qui ciblent les sphères de glioblastome d’origine patiente est ensuite comparée pour illustrer comment cette imitation BBTB peut être utilisée pour visualiser le passage des composés du côté sanguin vers le côté cérébral. Le signal fluorescent associé au NP110 se co-localise avec les lysosomes dans les cellules endothéliales, les astrocytes et les cellules tumorales. En outre, les NP110 sont détectés entre les cellules endothéliales et les astrocytes, en passant par les pores membranaires de l’insert.

Le passage des NP110 est quantifié en mesurant la fluorescence à partir d’échantillons prélevés sur le sang et le cerveau, et ces valeurs sont comparées à celles des nanoparticules déterminées qui sont de 350 nanomètres. Comme on peut le voir, seuls les NP110 sont capables de croiser les imitations BBTB, tandis que NP350 est resté sur le côté sanguin, ce qui entraîne des valeurs de perméabilité plus faibles pour ces nanoparticules. Manipuler l’insert avec soin, et écarter prudemment la suspension cellulaire des astrocytes sur le côté cérébral de l’insert sans contact direct de la membrane.

Tout dommage de la membrane entraînera une fuite. Cette méthode peut être adaptée pour répondre à la question de la livraison cérébrale de charges utiles administrées périphériquement. En utilisant différents inserts avec de plus grands pores membranaires, il est également possible d’étudier l’extravasation cellulaire.

Cette technique peut être modifiée en utilisant différents types de cellules pour imiter d’autres barrières cellulaires. Il ouvre également la voie à une recherche plus responsable et éthique, visant à réduire le nombre d’animaux de laboratoire utilisés pour la validation des médicaments anticancéraux. S’il vous plaît rappelez-vous que le paraformaldéhyde est un produit chimique très toxique et doit être manipulé en conséquence.

Aussi, soyez prudent tout en utilisant un scalpel pointu pour extraire les membranes des inserts.