Con el fin de desarrollar nuevos fármacos y compuestos que se dirigen a los tumores en el sistema nervioso central, la accesibilidad y el paso a través de la barrera hematoencefálica es muy importante. Aunque la citotoxicidad de los compuestos se puede medir fácilmente incubando las células con las moléculas terapéuticas, realmente no dice nada sobre la entrega real al sitio del tumor en el cerebro. Para abordar este problema, desarrollamos el siguiente protocolo que describe cómo recrear la barrera tumoral blood - brain in vitro en un plato.
El uso de células inmortalizadas de origen murino u humano hace que este ensayo sea muy flexible. También se puede escalar fácilmente para examinar docenas de compuestos con alta reproducibilidad. Además, este método permite cuantificar y visualizar el paso y la capacidad de orientación de los compuestos antes de proceder con modelos preclínicos.
Por lo tanto, nuestro método reemplaza parcialmente los modelos animales mediante el uso de las líneas celulares preestablecidas. La inclusión de células tumorales cerebrales derivadas del paciente ensaya la heterogeneidad del paciente, mientras que el uso de células inmortalizadas para establecer la barrera hematoencefálica asegura la reproducibilidad de los resultados. En conjunto, este modelo de barrera hematoencefálica ofrece una herramienta realmente interesante para ensayar la difusión de fármacos o la administración de vehículos farmacéuticos.
La demostración visual del método es crítica porque la siembra de las celdas en el lado opuesto de la inserción requiere una manipulación que no se describe a menudo en otros protocolos que utilizan una configuración similar. Por ejemplo, la obtención de la adhesión de los astrocitos cuando la plaquita se coloca al revés se beneficia mucho de la representación visual. Bajo una capucha de cultivo celular estéril, lave cuidadosamente los astrocitos cultivados con cinco mililitros de PBS estéril.
Utilice una bomba de vacío para desechar suavemente el PBS y agregue dos mililitros de reactivo de disociación celular durante cinco minutos para separar las células. Luego, agregue 10 mililitros de medio de cultivo celular de astrocito completo estéril al recipiente para inhibir la actividad del reactivo de disociación celular. Utilice una pipeta serológica estéril para transferir las células separadas del recipiente a un tubo estéril de 15 mililitros.
Centrifugar a 250 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, establece las inserciones. Utilice fórceps estériles para colocar las inserciones con el lado del cerebro hacia arriba en la tapa de una placa estéril de seis pocillos.
Cuando la centrifugación esté completa, deseche cuidadosamente el sobrenadante de la suspensión celular, y resuspender el pellet de astrocito en un mililitro de ABM-plus pipeteando suavemente el pellet en la pared del tubo hasta cinco veces. Luego, cuente las celdas y ajuste la densidad de la suspensión celular a 150.000 células en 400 microlitros de ABM-plus por plaquita. Coloque la suspensión celular en el centro del lado cerebral de la membrana del inserto y extiéndala cuidadosamente usando fuerza capilar con una punta de pipeta estéril.
Con el lado del cerebro de las plaquitas todavía hacia arriba, coloque la placa de seis pozos de nuevo en las plaquitas. Coloque la placa y las inserciones, con el cerebro hacia arriba, en una incubadora a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono para permitir la adhesión celular. Después de esto, revierta la placa de seis pozos de nuevo a su posición regular, con las inserciones ahora lado de sangre hacia arriba.
Agregue el medio y continúe la incubación como se describe en el protocolo de texto. Bajo una capucha de cultivo celular estéril, lave cuidadosamente las células endoteliales cultivadas con cinco mililitros de PBS estéril. Utilice una bomba de vacío para desechar suavemente el PBS y agregue dos mililitros de reactivo de disociación celular durante cinco minutos para separar las células.
A continuación, agregue 10 mililitros de medio de cultivo celular endotelial completo estéril al recipiente para inhibir la actividad del reactivo de disociación celular. Utilice una pipeta serológica estéril para transferir las células separadas del recipiente a un tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 250 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente.
Después de esto, deseche el sobrenadante, y resuspendir el pellet de célula endotelial en un mililitro de EBM-plus pipetiendo lentamente la suspensión celular en la pared del tubo hasta cinco veces. Cuente las células y ajuste la densidad de la suspensión celular a 200.000 células en 2,5 mililitros de cultivo celular endotelial desprovisto de suero y factor de crecimiento endotelial vascular-A por inserción. Recuperar la placa que contiene las plaquitas.
Deseche cuidadosamente el medio del lado sanguíneo y reemplácelo con los 2,5 mililitros de suspensión de células endoteliales. Luego, devuelva la placa a la incubadora, y déjela durante la noche para permitir que las células endoteliales se adhieran a la membrana. Al día siguiente, prepare una placa de seis pozos transfiriendo tres mililitros de ABM-menos precalentado a cada pozo.
Con fórceps estériles, manipule las plaquitas para desechar cuidadosamente el medio completo endotelial del lado sanguíneo, y coloque la plaquita en la nueva placa que contiene ABM-menos. A continuación, agregue 2,5 mililitros de EBM-menos. Deje las plaquitas en la incubadora con mínima perturbación física o variación de temperatura durante cinco días.
El día de la transferencia, sustituya el medio. Para la toma de imágenes por inmunofluorescencia, coloque hasta cuatro cubreobjetos de borosilicato estériles redondos en cada pocólieto de una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros de poli-D-lisina. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Mientras tanto, utilice una pipeta serológica estéril para transferir cuidadosamente las esferas tumorales del recipiente de cultivo celular a un tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar las esferas tumorales a 250 g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender suavemente las esferas en un mililitro de GBM-menos.
Cuente las celdas y ajuste la densidad de celdas a aproximadamente 10.000 esferas o 100.000 celdas por mililitro de GBM menos. A continuación, desechar la poli-D-lisina de los pozos, y enjuague los pozos tres veces con PBS estéril. Semilla de cada pozo de la placa con tres mililitros de la suspensión del esferoide tumoral, y transferir las plaquitas con la BBTB imitar a la suspensión celular tumoral.
Incubar durante la noche a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono para permitir que los lados del tumor sanguíneo y cerebral del ensayo lleguen al equilibrio. Al día siguiente, reemplace los medios en el lado sanguíneo con EBM-menos complementado con las moléculas, fármacos o nanopartículas de interés. Recoja las muestras a lo largo del tiempo para la cuantificación directa como se describió anteriormente.
En primer lugar, recoger 100 microlitros del medio de la sangre y los lados del cerebro de la imitación BBTB, y transferir cada uno a una placa separada de fondo plano, negro, de 96 pozos para las mediciones de fluorescencia posteriores. A continuación, prepare una solución de 50 micromolares de fluoresceína sódica en EBM-menos, asegurándose de preparar 2,5 mililitros por pozo. Precaliente esta solución a 37 grados centígrados y sustituya el medio del lado sanguíneo de las plaquitas por medios que contengan esta solución de fluoresceína de sodio.
Inicie un temporizador tan pronto como se sustituya el medio. Recoja cuidadosamente 100 microlitros de medios de los lados de la sangre y del cerebro de las plaquitas a los cinco minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos. Transfiera cada muestra a pozos separados de la placa negra de 96 pozos apropiada.
Utilice un lector de placas para cuantificar la fluorescencia de las muestras recogidas. En primer lugar, diluir el tinte fluorescente lisoso a la concentración de trabajo adecuada en medio precalegado. Añadir esto a las células, e incubar a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos.
Luego, enjuague las células tres veces con PBS helado. Deseche el PBS y agregue tres mililitros de 4%paraformaldehído helado al inserto. Incubar sobre hielo durante 10 minutos.
Después de esto, deseche el paraformaldehído y enjuague las células tres veces con PBS. Retire el PBS y contratuer los núcleos celulares utilizando una solución DAPI a una concentración final de un microgramo por mililitro en agua destilada. Incubar a temperatura ambiente durante siete minutos.
A continuación, retire el DAPI y lave las membranas tres veces con agua destilada. Corte cuidadosamente la membrana, retire el agua destilada y colóquela en una gota de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Agregue otra gota de medio de montaje en el otro lado de la membrana y cúbrala cuidadosamente con un vidrio de cubierta de borosilicato.
En este estudio, las células endoteliales fueron co-cultivadas con astrocitos para formar una interfaz similar a una barrera tumoral blood - brain en una configuración in vitro. Las imágenes confocales de la imitación murina BBTB muestran la expresión y localización celular de las proteínas de unión estrecha zonula ocludens-1 y claudin-5 en bEND3. Los contactos entre las células endoteliales y los astrocitos inducen claramente la reubicación de estas dos proteínas en los contactos endoteliales de célula a célula en comparación con los monocultivos bEND3.
Utilizando la tinción de inmunofluorescencia para visualizar los astrocitos que expresan GFAP en el lado cerebral de la membrana, es posible observar y estudiar los procesos astrocíticos y los pies finales que contactan las células endoteliales a través de la membrana. Para comparar los valores de permeabilidad de las imitaciones in vitro de BBTB con la barrera hematoencefálica in vitro, la difusión en tiempo real de fluoresceína sódica se obtiene una imagen a través de una ventana craneal implantada en ratones desnudos. Utilizando un microscopio estéreo de fluorescencia, la difusión de fluoresceína sódica de los capilares de los vasos sanguíneos de los vasos sanguíneos de los vasos sanguíneos principales se registra antes, durante y después de la inyección sistémica de la sonda.
La transcitotosis de nanopartículas que se dirigen a las esferas de glioblastoma derivadas del paciente se compara entonces para ilustrar cómo esta imitación de BBTB se puede utilizar para visualizar el paso de compuestos desde el lado de la sangre al lado del cerebro. La señal fluorescente asociada al NP110 se co-localiza con los lisosomas en las células endoteliales, astrocitos y células tumorales. Además, los NP110 se detectan entre las células endoteliales y los astrocitos, pasando a través de los poros de membrana de la plaquita.
El paso de NP110s se cuantifica midiendo la fluorescencia de muestras recogidas tanto del lado de la sangre como del cerebro, y estos valores se comparan con las nanopartículas determinadas que son 350 nanómetros. Como se puede ver, sólo los NP110 son capaces de cruzar las imitaciones BBTB, mientras que NP350 permaneció en el lado de la sangre, lo que resultó en valores de permeabilidad más bajos para estas nanopartículas. Manipule el inserto con cuidado, y extienda con cautela la suspensión de la célula de astrocitos en el lado cerebral de la plaquita sin contacto directo de la membrana.
Cualquier daño de la membrana resultará en fugas. Este método se puede adaptar para responder a la pregunta de la entrega cerebral de cargas útiles administradas periféricamente. Mediante el uso de diferentes inserciones con poros de membrana más grandes, también es posible estudiar la extravasación celular.
Esta técnica se puede modificar mediante el uso de diferentes tipos de células para imitar otras barreras celulares. También allana el camino a una investigación más responsable y ética, con el objetivo de reducir el número de animales de laboratorio utilizados para la validación de fármacos contra el cáncer. Recuerde que el paraformaldehído es un producto químico muy tóxico y debe manipularse en consecuencia.
Además, tenga cuidado al usar un bisturí afilado para extraer las membranas de las inserciones.
