Для того, чтобы разработать новые препараты и соединения, которые нацелены на опухоли в центральной нервной системе, доступность и прохождение через гемово-мозговой барьер имеет очень важное значение. Хотя цитотоксичность соединений можно легко измерить путем инкубации клеток с терапевтическими молекулами, это на самом деле ничего не говорит о фактической доставке в место опухоли в головном мозге. Для решения этой проблемы мы разработали следующий протокол, который описывает, как воссоздать гемово-мозговой опухолевый барьер in vitro на блюде.
Использование увековеченных клеток мурина или человеческого происхождения делает этот анализ очень гибким. Он также может быть легко масштабируется до экрана десятки соединений с высокой воспроизводимостью. Кроме того, этот метод позволяет как количественной оценки и визуализации прохода и ориентации способности соединений, прежде чем приступить к доклинкическим моделям.
Таким образом, наш метод частично заменяет модели животных с помощью заранее установленных клеточных линий. Включение полученных пациентом опухолевых клеток головного мозга анализзирует неоднородность пациента, в то время как использование увековеченных клеток для установления гемово-мозгового барьера обеспечивает воспроизводимость результатов. В общей сложности, эта модель гемового барьера предлагает действительно интересный инструмент для анализа распространения наркотиков или доставки наркотиков транспортных средств.
Визуальная демонстрация метода имеет решающее значение, поскольку посев ячеек на противоположной стороне вставки требует манипуляций, которые не часто описаны в других протоколах с использованием аналогичной настройки. Например, получение адгезии астроцитов при размещении вставки с ног на голову приносит высокую пользу от визуального представления. Под стерильным клеточным вытяжки культуры, тщательно мыть культурные астроциты с пятью миллилитров стерильных PBS.
Используйте вакуумный насос, чтобы аккуратно отказаться от PBS, и добавить два миллилитров реагенции клеток в течение пяти минут, чтобы отделить клетки. Затем добавьте 10 миллилитров стерильной полной среды культуры астроцитов к сосуду, чтобы ингибировать активность реагента диссоциации клеток. Используйте стерильную серологическую пипетку для переноса отдельных клеток из сосуда в стерильную 15-миллилитровую трубку.
Центрифуга при температуре 250 г в течение трех минут при комнатной температуре. Между тем, изутовьте вставки. Используйте стерильные типсы, чтобы поместить вставки с мозговой стороной вверх на крышку стерильной пластины из шести хорошо.
Когда центрифугация завершена, тщательно отбросьте супернатант из клеточной подвески и повторно сожмите гранулы астроцита в один миллилитр ABM-плюс, аккуратно трубя гранулы на стене трубки до пяти раз. Затем подсчитайте клетки и отрегулируйте плотность клеточной подвески до 150 000 ячеек в 400 микролитров ABM-плюс на вставку. Поместите подвеску клетки в середину мозговой стороны мембраны вставки, и тщательно распределить его с помощью капиллярной силы с стерильной наконечником пипетки.
С мозговой стороны вставки еще вверх, место шесть хорошо пластины обратно на вставки. Поместите пластину и вставки, с мозгом вверх, в инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа, чтобы позволить клеточной адгезии. После этого, вернуть шесть хорошо пластины обратно в свое обычное положение, с вставками теперь кровь сторону вверх.
Добавьте носитель и продолжайте инкубацию, как указано в текстовом протоколе. Под стерильным капюшоном культуры клеток, тщательно мыть культурные эндотелиальные клетки с пятью миллилитров стерильных PBS. Используйте вакуумный насос, чтобы аккуратно отказаться от PBS, и добавить два миллилитров реагенции клеток в течение пяти минут, чтобы отделить клетки.
Затем добавьте 10 миллилитров стерильной полной эндотелиальной клеточной культуры среды к сосуду, чтобы ингибировать активность реагента диссоциации клеток. Используйте стерильную серологическую пипетку для переноса отдельных клеток из сосуда в стерильную 15-миллилитровую трубку. Центрифуга при температуре 250 г в течение трех минут при комнатной температуре.
После этого, отбросить супернатант, и повторно использовать эндотелиальные гранулы клетки в один миллилитр EBM-плюс медленно трубопроводов клеточной подвески на стене трубки до пяти раз. Подсчитайте клетки и отрегулируйте плотность клеточной суспензии до 200 000 клеток в 2,5 миллилитров эндотелиальной клеточной культуры, лишенной сыворотки и сосудистого эндотелиального фактора роста-А на вставку. Извлечения пластины, содержащей вставки.
Аккуратно отбросьте среду со стороны крови и замените ее 2,5 миллилитров эндотелиальной клеточной подвески. Затем верните пластину в инкубатор и оставьте ее на ночь, чтобы эндотелиальные клетки прилипли к мембране. На следующий день подготовьте шестиявкую пластину, переведя по три миллилитров предварительно разогретого ПРО-минуса на каждую колодец.
Используя стерильные типсы, обработать вставки, чтобы тщательно отбросить эндотелиальную полную среду со стороны крови, и поместить вставку в новую пластину, содержащую ПРО-минус. Затем добавьте 2,5 миллилитров EBM-минус. Оставьте вставки в инкубаторе с минимальными физическими нарушениями или изменением температуры в течение пяти дней.
В день трансфера замените носитель. Для визуализации иммунофлюоресценции поместите до четырех круглых стерильных борозиликатных крышки в каждый колодец из шести хорошо пластины, содержащей два миллилитров поли-D-лизина. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
Между тем, используйте стерильный серологический пипетку, чтобы тщательно перенести опухолевые сферы из клеточной культуры сосуда в 15-миллилитровую стерильную трубку. Центрифуга опухолевых сфер 250 раз г в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и аккуратно мизерьте сферы в один миллилитр GBM-минус.
Подсчитайте клетки и отрегулируйте плотность клеток примерно до 10 000 сфер или 100 000 ячеек на миллилитр GBM-минус. Затем выбросьте поли-D-лизин из колодцев и трижды промойте колодцы стерильным PBS. Семя каждого хорошо пластины с тремя миллилитров опухоли сфероидной подвески, и передать вставки с BBTB имитировать на подвеску опухолевых клеток.
Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа, чтобы кровь и мозг опухоли стороны анализа прийти к равновесию. На следующий день замените средства массовой информации в стороне крови EBM-минус, дополненные молекулами, лекарствами или наночастицами, представляющими интерес. Соберите образцы с течением времени для прямой количественной оценки, как описано ранее.
Во-первых, собрать 100 микролитров среды как из крови, так и из мозга стороны BBTB имитировать, и передать каждый в отдельный плоским дном, черный, 96-хорошо пластины для последующих измерений флуоресценции. Далее приготовьте 50-микромолярный раствор флуоресцента натрия в EBM-минусе, убедившись, что приготовьте 2,5 миллилитров на колодец. Предварительно разогреть этот раствор до 37 градусов по Цельсию, и заменить средства массовой информации со стороны крови вставки с средствами, содержащими этот раствор флуорескеина натрия.
Запустите таймер, как только среда будет заменена. Тщательно соберите 100 микролитров мультимедиа как с стороны крови, так и со стороны мозга вставок за пять минут, 30 минут, 60 минут и 120 минут. Перенесите каждый образец в отдельные скважины соответствующей черной пластины 96 скважин.
Используйте считыватель пластин для количественной оценки флуоресценции из собранных образцов. Во-первых, разбавить лизосом флуоресцентный краситель до соответствующей рабочей концентрации в предварительно разогретой среде. Добавьте это к клеткам, и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%carbon dioxide в течение 45 минут.
Затем, промыть клетки три раза с ледяной PBS. Отбросьте PBS, и добавьте 3 миллилитров ледяного 4%paraformaldehyde к скважинам и 2.5 миллилитров к вставке. Инкубировать на льду в течение 10 минут.
После этого, отбросить параформальдегид, и промыть клетки три раза с PBS. Удалите PBS и снимите ядра клеток с помощью раствора DAPI при конечной концентрации одного микрограмма на миллилитр в дистиллированной воде. Инкубировать при комнатной температуре в течение семи минут.
Затем удалите DAPI и трижды промойте мембраны дистиллированной водой. Аккуратно вырежьте мембрану, удалите дистиллированную воду и поместите ее на каплю монтажной среды на слайде стеклянного микроскопа. Добавьте еще одну каплю монтажной среды на другой стороне мембраны и аккуратно накройте ее борозиликатным стеклом.
В этом исследовании эндотелиальные клетки были совместно культурируются с астроцитами, чтобы сформировать гемово-мозговой опухолевой барьер, как интерфейс в экстракорпоральной установки. Конфокальные изображения murine BBTB имитируют показывает экспрессию и клеточной локализации плотного соединения белков zonula occludens-1 и claudin-5 в bEND3. Контакты между эндотелиальными клетками и астроцитами явно индуцирует перемещение этих двух белков к эндотелиальным контактам между клетками по сравнению с монокультурами bEND3.
Используя окрашивание иммунофлюоресценции для визуализации астроцитов, выражаюющих GFAP на стороне мозга мембраны, можно наблюдать и изучать астроцитатические процессы и контактировать с эндотелиальными клетками через мембрану. Для сравнения значений проницаемости in vitro BBTB имитирует в пробирке гемового мозга барьер, в режиме реального времени диффузии флуоресцеина натрия изображен через черепное окно имплантированных в обнаженных мышей. С помощью стерео микроскопа флуоресценции натрия диффузии из капилляров кровеносных сосудов, полученных из основных кровеносных сосудов пиал регистрируется до, во время и после системной инъекции зонда.
Трансцитоз наночастиц, которые ориентированы на пациента полученных глиобластомы сфер затем сравнивается, чтобы проиллюстрировать, как это BBTB имитировать могут быть использованы для визуализации прохождения соединений со стороны крови в сторону мозга. NP110-ассоциированный флуоресцентный сигнал со-локализуется с лизосомами в эндотелиальных клетках, астроцитах и опухолевых клетках. Кроме того, NP110s обнаруживаются между эндотелиальными клетками и астроцитами, проходящими через мембранные поры вставки.
Прохождение NP110s количественно путем измерения флуоресценции из образцов, собранных из крови и мозга, и эти значения сравниваются с теми, определяется наночастиц, которые 350 нанометров. Как видно, только NP110s способны пересечь BBTB имитирует, в то время как NP350 остался на стороне крови, в результате чего более низкие значения проницаемости для этих наночастиц. Ручка вставки с осторожностью, и осторожно распространения астроцитов клеточной подвески на мозговой стороне вставки без прямого контакта мембраны.
Любое повреждение мембраны приведет к утечке. Этот метод может быть адаптирован, чтобы ответить на вопрос о доставке мозга периферийно управляемых полезных нагрузок. С помощью различных вставок с большими мембранных пор, это также можно изучить экстравазии клеток.
Этот метод может быть изменен с помощью различных типов клеток, чтобы имитировать другие клеточные барьеры. Он также прокладывает путь к более ответственным и этическим исследованиям, направленным на сокращение числа лабораторных животных, используемых для проверки противоопухоляных препаратов. Пожалуйста, помните, что параформальдегид является очень токсичным химическим веществом и должны быть обработаны соответствующим образом.
Кроме того, будьте осторожны при использовании острого скальпеля для извлечения мембран из вставок.
