Para desenvolver novas drogas e compostos que visam tumores no sistema nervoso central, a acessibilidade e a passagem através da barreira hematoencefálica é altamente importante. Embora a citotoxicidade dos compostos possa ser facilmente medida incubando as células com as moléculas terapêuticas, ela realmente não diz nada sobre a entrega real ao local do tumor no cérebro. Para resolver essa questão, desenvolvemos o seguinte protocolo que descreve como recriar a barreira tumoral hematoencefálica in vitro em um prato.
O uso de células imortalizadas de origem murina ou humana torna este ensaio muito flexível. Ele também pode ser facilmente dimensionado para tela dezenas de compostos com alta reprodutibilidade. Além disso, este método permite tanto quantificação quanto visualização da passagem e capacidade de segmentação dos compostos antes de prosseguir com modelos pré-clínicos.
Portanto, nosso método substitui parcialmente os modelos animais usando as linhas celulares pré-estabelecidas. A inclusão de células tumorais cerebrais derivadas do paciente ensaios sobre a heterogeneidade do paciente, enquanto o uso de células imortalizadas para estabelecer a barreira hematoencefálica garante a reprodutibilidade dos resultados. Ao todo, este modelo de barreira hemencefálica oferece uma ferramenta realmente interessante para avaliar a difusão da droga ou a entrega de veículos medicamentosos.
A demonstração visual do método é fundamental porque a semeadura das células do lado oposto da inserção requer manipulação que não é frequentemente descrita em outros protocolos usando configuração semelhante. Por exemplo, obter a adesão de astrócitos quando a inserção é colocada de cabeça para baixo altamente se beneficia da representação visual. Sob uma capa de cultura celular estéril, lave cuidadosamente os astrócitos cultivados com cinco mililitros de PBS estéreis.
Use uma bomba de vácuo para descartar suavemente o PBS e adicione dois mililitros de reagente de dissociação celular por cinco minutos para desprender as células. Em seguida, adicione 10 mililitros de cultura celular astrócito completa estéril ao vaso para inibir a atividade do reagente de dissociação celular. Use uma pipeta sorológica estéril para transferir as células separadas do vaso para um tubo estéril de 15 mililitros.
Centrifugar a 250 vezes g por três minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, coloque as pastilhas. Use fórceps estéreis para colocar as pastilhas com o lado cerebral na tampa de uma placa estéril de seis poços.
Quando a centrifugação estiver completa, descarte cuidadosamente o supernatante da suspensão celular e resuspenque a pelota de astrócito em um mililitro de ABM-plus, esbobinando suavemente a pelota na parede do tubo até cinco vezes. Em seguida, conte as células e ajuste a densidade de suspensão celular para 150.000 células em 400 microliters de ABM-plus por inserção. Coloque a suspensão celular no meio do lado cerebral da membrana da inserção, e espalhe-a cuidadosamente usando força capilar com uma ponta de pipeta estéril.
Com o lado cerebral das pastilhas ainda para cima, coloque a placa de seis poços de volta nas pastilhas. Coloque a placa e as pastilhas, com o lado cerebral para cima, em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a adesão celular. Depois disso, reverta a placa de seis poços de volta à sua posição regular, com as pastilhas agora lado sanguíneo para cima.
Adicione o meio e continue a incubação conforme descrito no protocolo de texto. Sob uma capa de cultura celular estéril, lave cuidadosamente as células endoteliais cultivadas com cinco mililitros de PBS estéreis. Use uma bomba de vácuo para descartar suavemente o PBS e adicione dois mililitros de reagente de dissociação celular por cinco minutos para desprender as células.
Em seguida, adicione 10 mililitros de cultura celular endotelial completa estéril ao vaso para inibir a atividade do reagente de dissociação celular. Use uma pipeta sorológica estéril para transferir as células separadas do vaso para um tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 250 vezes g por três minutos em temperatura ambiente.
Depois disso, descarte o supernasciente e resuspenque a pelota da célula endotelial em um mililitro de EBM-plus, tubondo lentamente a suspensão celular na parede do tubo até cinco vezes. Conte as células e ajuste a densidade de suspensão celular para 200.000 células em 2,5 mililitros de cultura celular endotelial desprovida de fator de crescimento endotelial sérico e vascular -A por inserção. Recupere a placa que contém as pastilhas.
Descarte cuidadosamente o meio do lado do sangue e substitua-o pelos 2,5 mililitros de suspensão celular endotelial. Em seguida, devolva a placa à incubadora e deixe-a durante a noite para permitir que as células endoteliais aderam à membrana. No dia seguinte, prepare uma placa de seis poços transferindo três mililitros de ABM-menos pré-aquecidos para cada poço.
Utilizando fórceps estéreis, manuseie as pastilhas para descartar cuidadosamente o meio endotelial completo do lado do sangue e coloque a inserção na nova placa contendo ABM-menos. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de EBM-menos. Deixe as pastilhas na incubadora com mínima perturbação física ou variação de temperatura por cinco dias.
No dia da transferência, substitua o meio. Para a imagem de imunofluorescência, coloque até quatro tampas de borossilicato estéril redondos em cada poço de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de poli-D-lisina. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
Enquanto isso, use uma pipeta sorológica estéril para transferir cuidadosamente as esferas tumorais do vaso de cultura celular para um tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar as esferas tumorais a 250 vezes g por três minutos. Descarte o supernatante e retire suavemente as esferas em um mililitro de GBM-menos.
Conte as células e ajuste a densidade celular para aproximadamente 10.000 esferas ou 100.000 células por mililitro de GBM-menos. Em seguida, descarte a poli-d-lysina dos poços e enxágue os poços três vezes com PBS estéril. Semente cada poço da placa com três mililitros da suspensão esferoide tumoral, e transfira as pastilhas com o BBTB imitar para a suspensão da célula tumoral.
Incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir que os lados do sangue e tumor cerebral do ensaio cheguem ao equilíbrio. No dia seguinte, substitua a mídia no lado sanguíneo por EBM-menos suplementada com as moléculas, drogas ou nanopartículas de interesse. Colete as amostras ao longo do tempo para quantificação direta como descrito anteriormente.
Primeiro, coletar 100 microliters do meio do sangue e dos lados cerebrais da mímica BBTB, e transferir cada um para uma placa separada de fundo plano, preto, 96 poços para medições subsequentes de fluorescência. Em seguida, prepare uma solução de 50 micromolar de fluoresceína de sódio em EBM-menos, certificando-se de preparar 2,5 mililitros por poço. Pré-aqueça esta solução a 37 graus Celsius, e substitua a mídia do lado sanguíneo das pastilhas por mídia contendo esta solução de fluoresceína de sódio.
Inicie um temporizador assim que o meio for substituído. Colete cuidadosamente 100 microliters de mídia do sangue e do lado cerebral das pastilhas em cinco minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos. Transfira cada amostra para separar poços da placa preta apropriada de 96 poços.
Use um leitor de placas para quantificar a fluorescência das amostras coletadas. Primeiro, diluir o corante fluorescente lysossom para a concentração de trabalho adequada em meio pré-aquecido. Adicione isso às células e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 45 minutos.
Em seguida, enxágue as células três vezes com PBS gelado. Descarte o PBS e adicione três mililitros de paraformaldeído 4% frio aos poços e 2,5 mililitros à pastilha. Incubar no gelo por 10 minutos.
Depois disso, descarte o paraformaldeído e enxágue as células três vezes com PBS. Remova o PBS e contra-retiver os núcleos celulares usando uma solução DAPI em uma concentração final de um micrograma por mililitro em água destilada. Incubar em temperatura ambiente por sete minutos.
Em seguida, remova o DAPI e lave as membranas três vezes com água destilada. Corte cuidadosamente a membrana, remova a água destilada e coloque-a em uma gota de meio de montagem em um slide de microscópio de vidro. Adicione outra gota de meio de montagem do outro lado da membrana, e cubra-a cuidadosamente com um copo de tampa borossilicato.
Neste estudo, as células endoteliais foram co-cultivadas com astrócitos para formar uma interface de barreira tumoral hematoencefálica em uma configuração in vitro. A imagem confocal da mímica murine BBTB mostra a expressão e localização celular das proteínas de junção apertada zonula occludens-1 e claudin-5 em bEND3. Os contatos entre as células endoteliais e os astrócitos induzm claramente a realocação dessas duas proteínas para os contatos célula-célula endotelial em comparação com as monoculturas bEND3.
Usando a coloração da imunofluorescência para visualizar os astrócitos que expressam GFAP no lado cerebral da membrana, é possível observar e estudar os processos astrócitos e os pés finais entrando em contato com as células endoteliais através da membrana. Para comparar os valores de permeabilidade do BBTB in vitro imita com a barreira in vitro hematoencefálica, a difusão em tempo real da fluoresceína de sódio é imagem através de uma janela craniana implantada em camundongos nus. Usando um microscópio estéreo de fluorescência, a difusão de fluoresceína de sódio dos capilares do vaso sanguíneo derivados dos principais vasos sanguíneos pial é registrada antes, durante e após a injeção sistêmica da sonda.
A transcitose de nanopartículas que atingem esferas de glioblastoma derivadas do paciente é então comparada para ilustrar como esta mímica bbtb pode ser usada para visualizar a passagem de compostos do lado sanguíneo para o lado cerebral. O sinal fluorescente associado ao NP110 co-localiza com os lysosomos nas células endoteliais, astrócitos e células tumorais. Além disso, np110s são detectados entre as células endoteliais e os astrócitos, passando pelos poros de membrana da inserção.
A passagem de NP110s é quantificada medindo a fluorescência de amostras coletadas tanto do lado do sangue quanto do cérebro, e esses valores são comparados com as nanopartículas determinadas que são 350 nanômetros. Como pode ser visto, apenas np110s são capazes de atravessar as mímicas BBTB, enquanto NP350 permaneceu no lado do sangue, resultando em valores de permeabilidade mais baixos para essas nanopartículas. Manuseie a inserção com cuidado e espalhe cautelosamente a suspensão celular de astrócito no lado cerebral da pastilha sem contato direto com a membrana.
Qualquer dano da membrana resultará em vazamento. Este método pode ser adaptado para responder à questão da entrega cerebral de cargas administradas periféricas. Usando diferentes pastilhas com poros de membrana maiores, também é possível estudar extravasão celular.
Esta técnica pode ser modificada usando diferentes tipos de células para imitar outras barreiras celulares. Também abre caminho para uma pesquisa mais responsável e ética, visando reduzir o número de animais de laboratório usados para validação de medicamentos anticâncicos. Lembre-se que o paraformaldeído é um químico muito tóxico e deve ser tratado de acordo.
Além disso, tenha cuidado ao usar um bisturi afiado para extrair as membranas das pastilhas.
