中枢神経系の腫瘍を標的とする新しい薬剤や化合物を開発するためには、血液脳関門を通過するアクセシビリティと通過が非常に重要です。化合物の細胞毒性は、治療分子で細胞をインキュベートすることによって簡単に測定することができますが、それは実際に脳内の腫瘍部位への実際の送達について何も教えてくれません。この問題に対処するために、我々は、皿の上にインビトロで血液脳腫瘍関門を再現する方法を記述する次のプロトコルを開発しました。
マウスまたはヒト起源の不死化細胞の使用は、このアッセイを非常に柔軟にします。また、容易に高い再現性と化合物の数十をスクリーニングするためにスケールアップすることができます。さらに、この方法は、前臨床モデルを進める前に、化合物の通過および標的化能力の定量および可視化の両方を可能にする。
したがって、我々の方法は、事前に確立された細胞株を使用して動物モデルを部分的に置き換える。患者由来の脳腫瘍細胞を含めることは患者の異質性をアッセイし、血液脳関門を確立するために不死化細胞を使用することは結果の再現性を保証する。全体として、この血液脳関門モデルは、薬物拡散または薬物車両の送達をアッセイする本当に興味深いツールを提供します。
このメソッドの視覚的なデモンストレーションは、挿入の反対側にあるセルのシード処理には、同様の設定を使用して他のプロトコルではあまり説明されない操作が必要であるため、非常に重要です。例えば、挿入物が逆さまに配置されたときにアストロサイトの接着を得ることは、視覚的表現から非常に利点を得る。滅菌細胞培養フードの下で、培養したアストロサイトを5ミリリットルの無菌PBSで慎重に洗浄します。
真空ポンプを使用してPBSを静かに廃棄し、2ミリリットルの細胞解離試薬を5分間加え、細胞を取り外します。次いで、10ミリリットルの無菌完全なアストロサイト細胞培養液を容器に加え、細胞解離試薬の活性を阻害する。滅菌血清学的ピペットを使用して、剥離した細胞を容器から滅菌15ミリリットルチューブに移します。
室温で3分間250回gで遠心分離機。その間、挿入物を設定します。滅菌鉗子を使用して、無菌の6ウェルプレートの蓋の上に脳側を持つインサートを配置します。
遠心分離が完了したら、慎重に細胞懸濁液から上澄み液を捨て、管の壁のペレットを5回まで軽くピペット化してABMプラスの1ミリリットルでアストロサイトペレットを再懸濁する。次に、細胞を数え、細胞懸濁液密度を挿入あたり400マイクロリットルのABMプラスで150,000細胞に調整した。細胞懸濁液をインサートの膜の脳側の真ん中に入れ、滅菌ピペットチップを用いて慎重に毛細血管力で広げます。
インサートの脳側を上に置いて、6ウェルプレートをインサートの上に戻します。プレートとインサートを、脳側を上にして、摂氏37度のインキュベーターと5%の二酸化炭素に入れ、細胞接着を可能にします。この後、6ウェルプレートを通常の位置に戻し、インサートを血液側を上に戻します。
中型を追加し、テキストプロトコルで概説されているようにインキュベーションを続行します。滅菌細胞培養フードの下で、培養した内皮細胞を5ミリリットルの無菌PBSで慎重に洗浄する。真空ポンプを使用してPBSを静かに廃棄し、2ミリリットルの細胞解離試薬を5分間加え、細胞を取り外します。
次いで、10ミリリットルの無菌完全な内皮細胞培養液を容器に加え、細胞解離試薬の活性を阻害する。滅菌血清学的ピペットを使用して、剥離した細胞を容器から滅菌15ミリリットルチューブに移します。室温で3分間250回gで遠心分離機。
この後、上清を捨て、チューブの壁の細胞懸濁液を5回までゆっくりとピペット化して、EBMプラスの1ミリリットルで内皮細胞ペレットを再懸濁する。細胞を数え、細胞懸濁密度を2.5ミリリットルの内皮細胞培養で200,000細胞に調整し、挿入あたり血清および血管内皮増殖因子-Aを欠いた。挿入物を含むプレートを取得します。
慎重に血液側から培地を捨て、内皮細胞懸濁液の2.5ミリリットルに置き換えます。次いで、プレートをインキュベーターに戻し、内皮細胞が膜に付着できるように一晩放置する。翌日、各ウェルに事前に温めたABM-マイナスの3ミリリットルを移すことによって、6ウェルプレートを準備します。
滅菌鉗子を使用して、インサートを取り扱って血液側から内皮完全培地を慎重に廃棄し、ABM-マイナスを含む新しいプレートに挿入物を入れる。その後、EBM-マイナスの 2.5 ミリリットルを追加します。インキュベーターに挿入物を残し、物理的な乱れまたは温度変化を最小限に抑えて5日間放置します。
転送日に、媒体を交換してください。免疫蛍光イメージングの場合、ポリD-リジンの2ミリリットルを含む6ウェルプレートの各ウェルに最大4つの丸い無菌ホウケイ酸カバーリップを配置します。室温で30分間インキュベートします。
一方、滅菌血清学的ピペットを使用して、細胞培養容器から15ミリリットルの滅菌チューブに腫瘍球を慎重に移す。腫瘍球を250回gで3分間遠心分離する。上清を捨て、球体を1ミリリットルのGBMマイナスで静かに再中断します。
セルを数え、セル密度を約 10,000 の球または 100,000 細胞に調整します( GBM-マイナスのミリリットルあたり)。次に、ポリD-リジンをウェルから捨て、滅菌PBSでウェルを3回リンスします。各プレートのウェルに3ミリリットルの腫瘍スフェロイド懸濁液を播種し、BBTBを模倣してインサートを腫瘍細胞懸濁液に移す。
摂氏37度で一晩、5%の二酸化炭素でインキュベートし、アッセイの血液および脳腫瘍側が平衡状態に達することを可能にする。翌日、血液側の培地を、目的の分子、薬物、またはナノ粒子で補ったEBM-マイナスに置き換えます。前に説明したように直接定量するために、時間をかけてサンプルを収集します。
まず、BBTBの血液と脳側の両方から培地の100マイクロリットルを収集し、その後の蛍光測定のためにそれぞれ別の平底、黒、96ウェルプレートに移します。次に、フルオレセインナトリウムの50マイクロモル溶液をEBM-マイナスで調製し、1ウェルあたり2.5ミリリットルを調製することを確認します。この溶液を摂氏37度に予め温め、このフッ素溶液を含む培地で挿入物の血液側から培地を交換する。
メディアを交換するとすぐにタイマーを開始します。5分、30分、60分、120分のインサートの血液と脳の両方の側から100マイクロリットルのメディアを慎重に収集します。各サンプルを適切な黒、96ウェルプレートの別々のウェルに移します。
プレートリーダーを使用して、収集したサンプルから蛍光を定量化します。まず、プリ温め培地で適当な働き濃度にリソソーム蛍光色素を希釈する。これを細胞に加え、摂氏37度で5%の二酸化炭素を45分間インキュベートします。
次に、氷冷PBSで細胞を3回リンスします。PBSを捨て、氷冷4%パラホルムアルデヒドをウェルに3ミリリットル、インサートに2.5ミリリットルを加えます。氷の上で10分間インキュベートします。
この後、パラホルムアルデヒドを捨て、PBSで細胞を3回リンスします。PBSを除去し、蒸留水中の1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度でDAPI溶液を用いて細胞核に対抗する。室温で7分間インキュベートします。
その後、DAPIを取り出し、蒸留水で3回膜を洗浄する。膜を丁寧に切り取り、蒸留水を取り出し、ガラス顕微鏡スライド上の取り付け媒体のドロップに置きます。膜の反対側に取り付け媒体の別のドロップを追加し、慎重にホウケイ酸カバーガラスでそれをカバーしています。
本研究では、内皮細胞をアストロサイトと共培養し、インビトロセットアップで血液脳腫瘍バリア様界面を形成した。マウスBBTB模倣体の共焦点イメージングは、bEND3におけるゾヌラオクルデン−1およびクローディン-5の緊密な接合タンパク質の発現および細胞局在化を示す。内皮細胞とアストロサイトとの接触は、bEND3単一培養と比較して、これらの2つのタンパク質を内皮細胞間接触に移すことを明確に誘導する。
免疫蛍光染色を用いて、膜の脳側のGFAP発現アストロサイトを可視化し、膜を通して内皮細胞に接触する天体の過程およびエンドフィートを観察・研究することが可能である。インビトロBBTBの擬似物の透過性値をインビトロ血液脳関門と比較するために、フルオレセインナトリウムのリアルタイム拡散はヌードマウスに埋め込まれた頭蓋窓を通して画像化される。蛍光ステレオ顕微鏡を用いて、主な血管から生じた血管の毛細血管からの蛍光ナトリウム拡散は、プローブの前、中、および全身注射後に記録される。
患者由来神経膠芽腫球を標的とするナノ粒子の経細胞化は、このBBTB模倣体を使用して血液側から脳側への化合物の通過を視覚化する方法を示すために比較される。NP110関連蛍光シグナルは、内皮細胞、アストロサイト、および腫瘍細胞におけるリソソームと共局化する。さらに、NP110sは、内皮細胞とアストロサイトの間で検出され、挿入物の膜細孔を通過する。
NP110sの通過は、血液側と脳側の両方から採取したサンプルから蛍光を測定することにより定量化され、これらの値は350ナノメートルのナノ粒子を決定したものと比較されます。見ることができるように、NP110sだけがBBTBの模倣体を横断することができ、NP350は血液側に残り、これらのナノ粒子の透過率値が低くなる。インサートを注意して取り扱い、膜に直接接触することなくインサートの脳側にアストロサイト細胞懸濁液を慎重に広げる。
膜の損傷は漏れをもたらす。この方法は、末梢投与されたペイロードの脳送達の質問に答えるために適合させることができる。より大きな膜孔を持つ異なるインサートを使用することにより、細胞の外挿を研究することも可能です。
この技術は、他の細胞の障壁を模倣するために異なる細胞タイプを使用して変更することができます。また、抗がん剤の検証に使用される実験動物の数を減らすことを目指して、より責任ある倫理的な研究への道を開きます。パラホルムアルデヒドは非常に有毒な化学物質であり、それに応じて処理する必要がありますので、覚えておいてください。
また、鋭いメスを使用して、挿入物から膜を抽出する際には注意してください。
