Merkezi sinir sistemindeki tümörleri hedef alan yeni ilaçlar ve bileşikler geliştirmek için kan-beyin bariyerinden erişilebilirlik ve geçiş son derece önemlidir. Bileşiklerin sitotoksisitesi kolayca terapötik moleküller ile hücreleri kuluçka ile ölçülebilir rağmen, gerçekten beyinde tümör bölgesine gerçek teslimat hakkında bir şey söylemez. Bu sorunu gidermek için, bir çanak üzerinde in vitro kan-beyin tümör bariyerini yeniden açıklayan aşağıdaki protokolü geliştirdik.
Murine veya insan kökenli ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanımı bu tahlili çok esnek hale getirir. Ayrıca kolayca yüksek tekrarlanabilirlik ile bileşiklerin ekran düzinelerce kadar ölçeklenebilir. Buna ek olarak, bu yöntem preklinik modellere geçmeden önce bileşiklerin geçişinin hem niceliksel hem de görselleştirilmesini sağlar.
Bu nedenle, yöntemimiz kısmen önceden kurulmuş hücre hatları kullanarak hayvan modelleri yerini alır. Hasta kaynaklı beyin tümörü hücrelerinin dahil edilmesi hastanın heterojenliğini tahlil ederken, kan-beyin bariyerini oluşturmak için ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanılması sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlar. Tamamen, Bu kan-beyin bariyermodeli ilaç difüzyon veya uyuşturucu araçların teslim tahlili için gerçekten ilginç bir araç sunuyor.
Ekse'nin karşı tarafındaki hücrelerin tohumlanması, benzer kurulum kullanılarak diğer protokollerde sık sık tanımlanmamış bir manipülasyon gerektirdiğinden yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Örneğin, ekleme baş aşağı yerleştirildiğinde astrositlerin yapışmasını elde görsel gösterimi son derece yararları. Steril bir hücre kültürü başlık altında, dikkatle steril PBS beş mililitre ile kültürlü astrositler yıkayın.
PBS'yi nazikçe atmak için bir vakum pompası kullanın ve hücreleri ayırmak için beş dakika boyunca iki mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin. Sonra, hücre bölünmesi reaktif aktivitesini inhibe etmek için damara steril komple astrosit hücre kültürü orta 10 mililitre ekleyin. Müstakil hücreleri damardan steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için steril serolojik pipet kullanın.
Oda sıcaklığında üç dakika boyunca 250 kez g santrifüj. Bu arada, ekler yola. Steril altı kuyulu bir plakanın kapağına beyin tarafı ile ekler yerleştirmek için steril forceps kullanın.
Santrifüj tamamlandığında, dikkatlice hücre süspansiyon supernatant atın ve abm artı bir mililitre içinde astrosit pelet yavaşça beş kez tüpün duvarında pelet borulama tarafından yeniden askıya. Daha sonra hücreleri sayın ve hücre süspansiyon yoğunluğunu kesici uç başına 400 mikrolitre ABM artı hücresayısına ayarlayın. Hücre süspansiyonuna kesici uç zarının beyin tarafının ortasına yerleştirin ve steril pipet ucuyla kılcal kuvvet kullanarak dikkatlice yayın.
Kesici uçların beyin tarafı hala yukarıyken, altı kuyulu plakayı kesici uçların üzerine geri yerleştirin. Hücre yapışmasına izin vermek için plakayı ve kesici uçları, beyin tarafı yukarı, 37 santigrat derecede bir kuvöze ve %5 karbondioksite yerleştirin. Bundan sonra, altı kuyulu plakayı normal pozisyonuna geri döndürün, kesici uçlar şimdi kan tarafını yukarı yaslar.
Orta ekleyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi kuluçka devam edin. Steril bir hücre kültürü başlık altında, dikkatle steril PBS beş mililitre ile kültürlü endotel hücreleri yıkayın. PBS'yi nazikçe atmak için bir vakum pompası kullanın ve hücreleri ayırmak için beş dakika boyunca iki mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin.
Sonra, hücre bölünmesi reaktif aktivitesini inhibe etmek için damara steril komple endotel hücre kültürü orta 10 mililitre ekleyin. Müstakil hücreleri damardan steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için steril serolojik pipet kullanın. Oda sıcaklığında üç dakika boyunca 250 kez g santrifüj.
Bundan sonra, supernatant atın ve eBM artı bir mililitre içinde endotel hücre pelet yavaş yavaş beş kez tüpün duvarında hücre süspansiyon pipetting tarafından yeniden askıya. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyon yoğunluğunu 200'e ayarlayın, serum ve vasküler endotelyal büyüme faktörü-A kesici uç başına yoksun 2,5 mililitre endotel hücre kültüründe 000 hücre. Kesici uçları içeren plakayı alın.
Dikkatle kan tarafında orta atın ve endotel hücre süspansiyon 2.5 mililitre ile değiştirin. Daha sonra, kuvöze plaka dönmek ve endotel hücrelerinin membrana uymak için izin vermek için bir gecede bırakın. Ertesi gün, her kuyuya önceden ısıtılmış ÜÇ mililitre ABM-eksi aktararak altı kuyulu bir tabak hazırlayın.
Steril çerteler kullanarak, endotel tam ortasını kan tarafından dikkatlice atmak için uçları dikkatlice takın ve kesici ucu ABM eksi içeren yeni plakaya yerleştirin. Sonra, EBM-eksi 2,5 mililitre ekleyin. Kesici uçları en az fiziksel rahatsızlık veya sıcaklık değişimi yle birlikte kuvözde beş gün bekletin.
Aktarım günü, ortamı değiştirin. İmmünofloresan görüntüleme için, poli-D-lizin iki mililitre içeren altı kuyuplaka her kuyu içine dört yuvarlak steril borosilikat kapakları yerleştirin. 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.
Bu arada, dikkatle hücre kültür damarından 15 mililitrelik steril tüp tümör küreleri aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Üç dakika boyunca 250 kez g tümör küreleri santrifüj. Supernatant atın ve yavaşça GBM-eksi bir mililitre küreler yeniden askıya.
Hücreleri sayın ve hücre yoğunluğunu mililitre başına 10,000 küre veya 100,000 hücreGBM eksi olarak ayarlayın. Daha sonra, poli-D-lizin kuyulardan atın ve steril PBS ile kuyuları üç kez durulayın. Tümör küresel süspansiyon üç mililitre ile plaka her iyi tohum, ve tümör hücre süspansiyon üzerine BBTB taklit ile ekler transfer.
Bir gecede 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin ve tahminin kan ve beyin tümörü taraflarının dengeye gelmesini sağlar. Ertesi gün, EBM-eksi molekülleri ile takviye ile kan tarafında medya değiştirin, ilaçlar, ya da ilgi nano tanecikleri. Daha önce açıklandığı gibi doğrudan niceleme için zaman içinde örnekleri toplayın.
İlk olarak, BBTB mimik kan ve beyin taraflarından hem kan ve beyin tarafında orta 100 mikrolitre toplamak ve sonraki floresan ölçümleri için ayrı bir düz dipli, siyah, 96-iyi plaka her transfer. Daha sonra, EBM-eksi sodyum floresan 50 mikromolar çözelti hazırlamak, iyi başına 2,5 mililitre hazırlamak için emin olun. Bu çözeltiyi 37 dereceye ısıtın ve kesici uçların kan tarafındaki ortamı bu sodyum floresan çözeltisini içeren ortamla değiştirin.
Ortam değiştirilir değiştirilmez bir zamanlayıcı başlatın. Kesici uçların kan ve beyin taraflarından beş dakika, 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakika boyunca 100 mikrolitre medya yı dikkatlice toplayın. Her numuneyi uygun siyah, 96 kuyulu plakanın ayrı kuyularına aktarın.
Toplanan örneklerden floresan ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. İlk olarak, önceden ısıtılmış ortamda uygun çalışma konsantrasyonuna lizozom floresan boya seyreltin. Bunu hücrelere ekleyin ve 45 dakika boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Daha sonra hücreleri buz gibi PBS ile üç kez durulayın. PBS atın ve eklemek için kuyulara buz gibi% 4 paraformaldehit üç mililitre ekleyin ve 2.5 mililitre. 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat.
Bundan sonra, paraformaldehit atın ve PBS ile hücreleri üç kez durulayın. PBS'yi çıkarın ve distile suda mililitre başına bir mikrogramlık bir mikrogramın son konsantrasyonunda dapi çözeltisi kullanarak hücre çekirdeklerini lekeleyin. Yedi dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.
Sonra, DAPI çıkarın ve distile su ile üç kez membranlar yıkayın. Membranı dikkatlice kesin, distile suyu çıkarın ve cam bir mikroskop kaydırağı üzerine bir damla montaj ortamının üzerine yerleştirin. Membranın diğer tarafına başka bir damla montaj ortamı ekleyin ve borosilikat kapak camı ile dikkatlice kapatın.
Bu çalışmada, endotel hücreleri in vitro kurulumda kan-beyin tümörü bariyerbenzeri bir arayüz oluşturmak için astrositlerle birlikte kültürlendi. murine BBTB mimik konfokal görüntüleme bEND3 sıkı kavşak proteinleri zonula oklüden-1 ve claudin-5 ekspresyonu ve hücresel lokalizasyonu gösterir. Endotel hücreleri ve astrositler arasındaki temaslar, bu iki proteinin bEND3 monokültürlerine göre endotel hücre-hücre temaslarına taşınmasına neden olur.
Membranın beyin tarafındaki GFAP ifade eden astrositleri görselleştirmek için immünororesans boyama kullanarak, membran aracılığıyla endotel hücrelerine temas eden astrositik süreçleri ve son ayakları gözlemlemek ve incelemek mümkündür. In vitro BBTB taklitlerinin geçirgenlik değerlerini in vitro kan-beyin bariyeri ile karşılaştırmak için, sodyum floresan gerçek zamanlı difüzyon çıplak fareler implante bir kafatası penceresi ile görüntülenir. Floresan stereo mikroskop kullanılarak, ana pial kan damarlarından kaynaklanan kan damarı kılcal damarlarından sodyum floresan difüzyonu probun sistemik enjeksiyonundan önce, sırasında ve sonrasında kaydedilir.
Hasta kaynaklı glioblastoma kürelerini hedef alan nano partiküllerin transistozu, bu BBTB miminin kan tarafından beyin tarafına geçen bileşiklerin geçişini görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için karşılaştırılır. NP110 ile ilişkili floresan sinyali endotel hücreleri, astrositler ve tümör hücrelerindeki lizozomlarla birlikte lokalize olur. Buna ek olarak, NP110s endotel hücreleri ve astrositler arasında tespit edilir, kesici uç membran gözenekleri geçerek.
NP110'ların geçişi, hem kan hem de beyin tarafından toplanan örneklerden alınan floresan ölçülerek ölçülür ve bu değerler 350 nanometre olan belirlenen nano taneciklerle karşılaştırılır. Görüldüğü gibi, sadece NP110s BBTB mimikler geçmek edebiliyoruz, NP350 kan tarafında kaldı, bu nano tanecikleri için daha düşük geçirgenlik değerleri ile sonuçlanan. Kesici ucu dikkatle ele alın ve membrana doğrudan temas etmeden kesici nin beyin tarafına astrosit hücre süspansiyonu dikkatlice yayıldı.
Membranda herhangi bir hasar sızıntısına neden olur. Bu yöntem, periferik olarak yönetilen yüklerin beyin teslimi sorusuna cevap vermek için uyarlanabilir. Daha büyük membran gözenekleri ile farklı ekler kullanarak, hücre ekstravazasyon çalışması da mümkündür.
Bu teknik, diğer hücresel engelleri taklit etmek için farklı hücre türleri kullanılarak değiştirilebilir. Ayrıca, kanserle mücadele de ilaç doğrulamaiçin kullanılan laboratuvar hayvanlarının sayısını azaltmayı amaçlayan daha sorumlu ve etik bir araştırmanın da önünü açıyor. Paraformaldehitin çok toksik bir kimyasal olduğunu ve buna göre ele alınması gerektiğini lütfen unutmayın.
Ayrıca, ekler membranlar ayıklamak için keskin bir neşter kullanırken dikkatli olun.
