שיטה זו מאפשרת לזהות, על ידי גישה לא פולשנית, חולה עם נגע neoplastic המעי הדם. בפרט, בדיקה זו מאפשרת, בשיתוף עם בדיקות המשמשות כיום בתוכנית הקרנת סרטן המעי הגס, כדי לחזות טוב יותר את נוכחותם של סרטן או סיכון גבוה יותר של נגעים חריגים. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, צנטריפוגה aliquot של כל שליטה חיובית, DNAs סטנדרטי, ו- DNA ספייק ב, בפורמט יבש במשך 10 שניות על מיני צנטריפוגה.
תן שימוש חוזר בשליטה החיובית עם 750 מיקרוליטרים של מים. תן מחדש את ה-DNA ספייק ב, המשמש שליטה פנימית אקסוגנית, כדי לבדוק את נוכחותם של מעכבים, עם 100 microliters של מים. עבור העקומה הסטנדרטית, בצע שימוש חוזר בתקן היבש עם 100 מיקרוליטרים של מים ובצע ארבעה דילולים של 1:5 החל מתסמת המלאי.
לאחר מכן, בזהירות מערבולת reagents במשך 15 שניות, ו צנטריפוגה בצנטריפוגה מיני במשך 10 שניות. למשך שימוש חוזר מלא, יש לאחסן את הריג'ים הנוזליים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש. כדי להכין את בקרת ה-DNA ספייק-אין 1x, לערבב חמישה microliters של ספייק FL-DNA עם 45 microliters של מים סטריליים.
עבור הדגימות, לערבב 75 microliters של כל מדגם עם 50 microliters של 1x ספייק ב- DNA, מניב נפח כולל של 125 microliters. תחילה, פתח את תוכנת ההפעלה qPCR. כדי להגדיר את הלוחית, הגדר את סוג באר עבור כל שמונת המיקומים בעמודה אחת, כסטנדרט.
הגדר את סוג הבאר עבור הבאר A2 ו- B2 כ- NTC. הגדר את סוג באר עבור הפקדים החיוביים, C2 ו- D2, כבלתי ידועים. ולהגדיר את סוג באר עבור כל העמדות האחרות כמו לא ידוע.
בחר את כל 96 המיקומים. הוסף את הצבעים, FAM ו- HEX ולחץ על סנכרן צלחת. לאחר מכן הגדר את הפרופיל התרמי, כפי שסופק.
הכינו את המספר הרצוי של רצועות 8 בארות המכילות תערובות הגברה ליופיפיליות שלמות, עם פריימרים ובדיקות ספציפיים המכוונים לדנ"א האנושי, והשליטה הפנימית. כדי להביא את התוכן לתחתית הצינורות, צנטריפוגה את הרצועות במשך 10 שניות. בעדינות להסיר את החותמים מן הרצועות, הקפד לא לאבד כל גלולה.
לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מים ל בארות הבקרה השליליות. 25 מיקרוליטרים של דנ"א לדוגמה כדי לדגום בארות ו-25 מיקרוליטרים של דנ"א שליטה חיובי ל בארות הבקרה החיוביות. לעקומה הסטנדרטית, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של באר רגילה 1, 2, 3 ו-4 בכל באר ייעודית.
השתמש באותיות אופטיות שטוחות עם 8 פסים כדי לסגור בזהירות את כל הרצועות והמערבולת למשך מספר שניות. צנטריפוגה הרצועות במשך 10 שניות, לטעון אותם לתוך המכשיר, ולהתחיל את הריצה. בסוף הריצה, עבור FAM FL-DNA A ו- HEX IC, בחר עמודות, A, C, E ו- G.For FAM FL-DNA B ו- HEX IC, בחר עמודות, B, D, F ו- H.עבור הכמות ההתחלתית של הכמויות הסטנדרטיות, הגדר 10 ננוגרם לתגובה עבור בארות A1 ו- B1, שתי ננוגרם לתגובה עבור C1 ו- D1, הצבע ארבעה ננוגרם לתגובה עבור E1 ו- B1 ונקודת אפס שמונה ננוגרם לתגובה עבור G1 ו- H1. לאחר מכן, הן עבור ערוצי FAM והן עבור ערוצי HEX, הגדר ערכי פלואורסצנטיות סף ל- 150.
בתיבה טבלת תוצאות, לחץ על אפשרויות עמודה ולאחר מכן, בחר הכל ולאחר מכן בסדר, כדי להשיג את התוצאות בשני הערוצים עם הערכים האחרונים שלהם Cq ודלתא R, המסופקים על-ידי תוכנת כלי qPCR בזמן אמת. Delta R מתאים לאחרונה לערך הפלואורסצנטיות מנורמל למחזור ההגברה האחרון. בתיבה טבלת תוצאות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הטבלה כדי לפתוח את תפריט ההקשר.
לחץ על שלח ל- Excel כדי לייצא את הנתונים הגולמיים. ואז להעלות את קובץ Excel על תוכנת ניתוח ייעודי לחישוב אוטומטי של כמות FL-DNA. מתוך השילוב של iFOBT וערכי FL-DNA להעריך עבור כל חולה, הסיכון לסרטן המעי הגס.
עקומות פלואורסצנטיות של מדגם חיובי מתאים מראות את אות הדגימה בערוץ HEX, שהוא הבקרה הפנימית, בטווח המקובל. אות חיובי הוא מעל הסף בערוץ FAM, אשר מראה את ההגברה של גנים היעד. עקומות פלואורסצנטיות של מדגם שלילי מתאים מראות את אות הדגימה בטווח המקובל בערוץ HEX.
אות הבקרה השלילית נמצא מתחת לסף בערוץ השאלות הנפוצות. מצד שני, עקומות של מדגם לא מתאים להראות את אות המדגם שאינו בטווח המקובל בערוץ HEX. סביר להניח עקב עיכוב פוטנציאלי.
לכן, מדגם זה חייב לחזור על עצמו, החל מן החילוץ. טבלת פלט ניתוח תוכנה מציגה נתונים הן עבור Mix A והן עבור Mix B במונחים של ריכוז FL-DNA עבור בקרות תגובה, דגימות קליניות ותוצאות בקרת איכות ריצה. לדגימה מספר ארבע אין תוצאות מכיוון שהיא לא עברה את בקרת האיכות.
זה חייב לחזור ולתבוא מחדש. אנא היזהר כאשר השתמש מחדש את ה-DNA עבור ספייק בשליטה על העקומה הסטנדרטית. וכאשר מפיצים DNAs שונים לרצועות 8 בארות, כמו גם במהלך זיהוי מולקולרי בסעיף ניתוח התוצאות.
שיטה זו חייבת להתבצע בשילוב עם בדיקת iFOBT כדי לאפשר הערכה טובה יותר של נגעים neoplastic המעי הירך, זה חייב להתבצע עם אותה מדגם צואה.
