הפרוטוקול שלנו מאפשר למדוד גילוי ואפליה של ריחות נדיפים עם פאנל של קולטני ריח. שיטה זו פותחת את האפשרות לפתח biosensors מבוססי קולטן ריח. טכניקה זו מאפשרת ניטור במבחנה בזמן אמת של הפעלת קולטן ריח על מולקולות ריח בשלב האדים.
זה ממלא את הפער בין במבחנה ו בגישות vivo. שיטה זו יכולה לשמש כדי להבין את הקינטיקה של אירועים שמובילים לתפיסת ריח, כולל התפקיד של אנזימים מטבוליים ריר. כדי להתחיל, להכין M10 ו M10 PSF על פי כתב היד.
תאים מתורבתים ב 10 מיליליטר של M10 PSF ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. שימו לב לצלחת התרבות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. כאשר הוא מגיע 100%confluence, לפצל את התאים לריכוז נמוך יותר על ידי שאפת התקשורת לשטוף את התאים בעדינות עם 10 מיליליטר של PBS.
לאחר מכן שאפו את ה-PBS והוסיפו שלושה מיליליטר של טריפסין-אדטה. תן לו להגיב במשך כדקה עד התאים להתנתק מן המנה. הוסף חמישה מיליליטר של M10 כדי להשבית את טריפסין, ואת פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים המחוברים לצלחת.
מעבירים את שמונת המיליליטרים של השעיית התא מהצלחת לצינור של 15 מיליליטר, ומעבירים את הצינור ב-200 פעמים למשך חמש דקות. שאפו את העל-טבעי והתינו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של M10 PSF על-ידי צינור למעלה ולמטה כדי לשבור כל מסת תא. הימנע מיצירת בועות בצינור.
כדי להשיג 20%confluence של תאים, להוסיף תשעה מיליליטר של M10 PSF בצלחת חדשה 1, 000 מילימטר תאים, ולהעביר מיליליטר אחד של פתרון התא המתווסף מחדש. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. מנה זו, היושבת על 20%, תגיע ל-100% התכנסות ב-48 שעות.
מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה להתבונן. קח 1/10 מתוך 100% צלחת תרבות קונפלונס תא. שאפו את התקשורת ושטפו את התאים בעדינות עם 10 מיליליטר של PBS.
לאחר מכן לטפל בתאים עם טריפסין-EDTA ו M10, צנטריפוגה, ולטפל שוב עם M10 PSF כפי שבוצע בעבר. כדי לממש צלחת אחת 96 באר, להוסיף 500 microliters מחמשת מיליליטר של תאים resuspended ל 5.5 מיליליטר של PSF M10 טרי.
פיפטה 50 מיקרוליטרים של התאים המושעים המדוללים לתוך כל באר של צלחת 96 באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ראשית, מניחים את הצלחת 96 היטב מתורבת בן לילה תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה, להתבונן קונפלונס התא, ולוודא שזה בין 30% ו 50% להכין תערובת transfection הראשון בצינור 1.5 מיליליטר המכיל את הפלסמידים המשותפים הצלחת כולה על פי כתב היד.
Rho-pCi היא שליטה שלילית וקטורית ריקה, ו Olfr1377 היא שליטה חיובית ידוע להגיב אצטופנון ריח נבדק. מפצלים את התערובת לשתי תערובות טרנס-דביקות המכילות את אחת פלסמידי הבקרה. הכן תערובת transfection שנייה המכילה 500 microliters של MEM ו 20 microliters של ליפופקטמין 2000 reagent.
מוסיפים חצי מהתערובת השנייה היטב לכל מאגר ומערבבים בעדינות על ידי צינור למעלה ולמטה. דגירה הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף חמישה מיליליטר של M10 עבור צלחת אחת 96 היטב.
מוסיפים 2.5 מיליליטר לתוך כל מאגר היטב ומערבבים בעדינות. החלף את ה- PSF M10 בצלחת 96 באר מצופה בעבר עם 50 מיקרוליטרים של המדיה האחרונה transfection. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
לאחר מכן פתח את הדלת של מד הזוהר והכנס את הצינור המחובר למשאבת הוואקום. שאבו את התא של הלומינומטר בן לילה. לאחר ההמרה, יש להתבונן בצלחת ה-96 בארות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבטיח התכנסות תאים בין 60% ל-100% הכן את פתרון הגירוי של תספורת המלח המאוזנת של האנק המכילה 10 מ"ל של HEPES וחמישה מילימטרים של D-glucose.
הסר את מדיום ההמרה מהצלחת 96 באר ולשטוף את התאים על ידי הוספת 50 microliters של פתרון גירוי טרי לכל באר. כדי לדלל את פתרון הריג'נט של GloSensor, פיפטה 2.75 מיליליטר של פתרון הגירוי לצינור של חמישה מיליליטר ולהוסיף 75 מיקרוליטרים של פתרון הריג'נט של CAMP. הסר את פתרון הגירוי מה בארות, ולהוסיף 25 microliters של פתרון reagent cAMP מדולל לכל באר.
הדגירה את צלחת 96 באר בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה ונונטת ריח במשך שעתיים. ראשית, לדלל את ריח אצטופנון ל 1%ב 10 מיליליטר של שמן מינרלי לכסות את הצינור. לפני תום זמן הדגירה של הדגירה של הדגירה, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תותבת הריח לכל באר בצלחת חדשה של 96 בארות.
לאחר מכן מניחים את צלחת הריח בתא הזוהר במשך חמש דקות כדי לצייד את התא במולקולות ריח נדיפות. הגדר את מד הזוהר כדי לתעד את הזוהר עם אפס שניות של השהיה במהלך 20 מחזורים של מדידת צלחת 90 שניות, עם 0.7 שניות של מרווח בין מחזורים. ממש לפני קריאת הצלחת, מוציאים את לוחית הריח מהתא.
בצלחת 96 באר המכיל את התאים מנודים, להוסיף 25 microliters של ריח בחלל בין בארות, במהירות לשים את הצלחת בחזרה לתוך התא. התחל את מדידת luminescence של כל הבארים במשך 20 מחזורים בתוך 30 דקות. לאחר מדידת הזוהר, הסר את הריח הנותר בתוך מד התאור על ידי שאיבת ריחות בתא הקריאה בהרחבה במשך שעתיים לפחות.
החלף באוויר צח על ידי שליחת אוויר דחוס במשך חמש דקות לפני הדגירה של הריח הבא, כדי למנוע זיהום צולב של נדיפות ריח. כדי להתחיל בניתוח נתונים, יצא את הנתונים מתווית הלומינומטר. ממוצע השכפולים של אותו OR עבור כל זמן הקלטה.
כדי לחשב את תגובת OR מנורמלת לכל פקד בסופו של דבר, חלק את הערך הווקטורי הריק לערך הממוצע OR בכל זמן הקלטה. לנרמל כל תגובת OR לפעילות הבסיסית שלהם על-ידי חלוקת תגובת OR הממוצעת באפס שניות לכל תגובת זמן הקלטה. כדי להשיג ערך תגובה יחיד של OR עבור העקומה של כל OR, סכם את כל ערכי ה- luminescence של כל זמן הקלטה עבור כל OR כדי להשיג את האזור מתחת לעקומה.
בניסוי זה, ההפעלה בזמן אמת של עכברים ORs על גירוי ריח אדים היה במעקב מעל 20 מחזורי מדידה. פקד וקטור ריק שימש כדי להבטיח כי הפעילויות הנגרמות על ידי ריח של ORs נבדק היו ספציפיים. הנתונים עבור כל באר מנורמלים תחילה לערך הווקטורי הריק הממוצע עבור כל מחזור.
לאחר מכן, כדי להשוות תגובות שונות של ORs, הנתונים היו מנורמלים לרמות OR של פעילות בסיס בראיה זו. ערכי הפעלה יחידה עבור כל OR חושבו על-ידי חישוב האזור מתחת לעקומה עבור כל OR על-ידי סיכום ערכי הפליטה של כל מחזורי המדידה. בנוסף, תגובות תלויות מינון ניתן למדוד באמצעות הגדלת מינוני ריח.
התגובה של Olfr1377 לגירוי אצטופנון בחמישה ריכוזים נרשמה. רק שלושת הריכוזים הגבוהים יותר הצליחו להפעיל את Olfr1377. הגירוי המורכב הטהור מראה נטייה להקטין את תגובת OR לאורך זמן, ככל הנראה עקב רעילות התא.
במהלך השלב, אתה צריך להוסיף את הריח מדולל בין הבאר, להיות מוכן להתחיל במהירות את ההקלטה של הצלחת. יש למזער את הזמן בין תוספת ריח לניטור וקבוע בין שני ניסויים. בתאי אטריה הם חומר biohazardous, אז להזכיר להיפטר התאים בבית המרקחת המתאימים.
