Unser Protokoll ermöglicht die Messung und Diskriminierung flüchtiger Gerüche mit einem Panel von Geruchsrezeptoren. Diese Methode eröffnet die Möglichkeit, geruchsrezeptorbasierte Biosensoren zu entwickeln. Diese Technik ermöglicht eine Echtzeit-In-vitro-Überwachung der Geruchsrezeptoraktivierung auf Geruchsmoleküle in der Dampfphase.
Es füllt die Lücke zwischen In-vitro- und In-vivo-Ansätzen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Kinetik von Ereignissen zu verstehen, die zur Geruchswahrnehmung führen, einschließlich der Rolle von schleimhautmetabolischen Enzymen. Um zu beginnen, bereiten M10 und M10 PSF nach dem Manuskript.
Die Zellen werden in 10 Milliliterm M10 PSF bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid kultiviert. Beobachten Sie die Kulturschale unter einem Phasenkontrastmikroskop. Wenn es 100% Zusammenfluss erreicht, teilen Sie die Zellen auf eine niedrigere Konzentration, indem Sie die Medien ansipirieren und die Zellen sanft mit 10 MilliliterPBS waschen.
Dann die PBS aspirieren und drei Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen. Lassen Sie es für etwa eine Minute reagieren, bis die Zellen von der Schale trennen. Fügen Sie fünf Milliliter M10 hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren, und Pipette nach oben und unten, um die an der Schale befestigten Zellen zu lösen.
Übertragen Sie die acht Milliliter Zellsuspension von der Schale in ein 15-Milliliter-Rohr, und zentrifugieren Sie das Rohr bei 200-mal-G für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in fünf Milliliterm M10 PSF wieder ab, indem Sie nach oben und unten pfeifen, um jede Zellmasse aufzubrechen. Vermeiden Sie blasen in der Röhre zu erstellen.
Um 20 % Deseinfluss von Zellen zu erhalten, fügen Sie neun Milliliter M10 PSF in eine neue 1.000-Millimeter-Zellkulturschale ein und übertragen Sie einen Milliliter der resuspendierten Zelllösung. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Dieses Gericht, das an 20% Zusammenfluss sitzt, wird 100% Zusammenfluss in 48 Stunden erreichen.
Legen Sie die Schale unter ein Phasenkontrastmikroskop, um es zu beobachten. Nehmen Sie 1/10 der 100%zelligen Konfluenzkulturschale. Saugen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen sanft mit 10 Milliliter PBS.
Behandeln Sie dann die Zellen mit Trypsin-EDTA und M10, Zentrifuge, und behandeln Sie wieder mit M10 PSF wie zuvor durchgeführt. Um eine 96-Well-Platte zu realisieren, fügen Sie 500 Mikroliter aus den fünf Millilitern resuspendierter Zellen auf 5,5 Milliliter frischem M10 PSF. Mischen Sie die Zellen und M10 PSF, ohne Luftblasen zu erzeugen.
Pipette 50 Mikroliter der verdünnten suspendierten Zellen in jeden Brunnen der 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Stellen Sie zunächst die 96-Well-Platte, die über Nacht kultiviert wurde, unter ein Phasenkontrastmikroskop, beobachten Sie den Zellzusammenfluss und stellen Sie sicher, dass sie zwischen 30% und 50% liegt. Bereiten Sie einen ersten Transfektionsmix in einem 1,5-Milliliter-Rohr vor, das die Plasmide enthält, die der gesamten Platte entsprechend dem Manuskript gemeinsam sind.
Rho-pCi ist eine leere Vektor-Negativkontrolle, und Olfr1377 ist eine positive Kontrolle bekannt, um auf das getestete Geruchsacetophenon reagieren. Teilen Sie die Mischung in zwei Transfektionsmischungen auf, die eines der Kontrollplasmide enthalten. Bereiten Sie eine zweite Transfektionsmischung mit 500 Mikroliter MEM und 20 Mikroliter Liptectamin 2000 Reagenz vor.
Fügen Sie die Hälfte der zweiten Mischung zu jedem Reservoir gut und sanft mischen, indem Sie nach oben und unten. Inkubieren Sie das Rohr für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie fünf Milliliter M10 für eine 96-Well-Platte hinzu.
2,5 Milliliter in jeden Behälter geben und sanft mischen. Ersetzen Sie den M10 PSF in der zuvor beschichteten 96-Well-Platte durch 50 Mikroliter der endletzten Transfektionsmedien. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren.
Öffnen Sie dann die Tür des Luminometers und legen Sie das mit der Vakuumpumpe verbundene Rohr ein. Vakuumieren Sie die Kammer des Luminometers über Nacht. Beobachten Sie nach der Transfektion die 96-Well-Platte unter einem Phasenkontrastmikroskop, um einen Zellzusammenfluss zwischen 60% und 100% zu gewährleisten. Bereiten Sie die Stimulationslösung von Hanks Balanced Salt Solution vor, die 10-Millimolar von HEPES und 5-Millimolar D-Glucose enthält.
Entfernen Sie das Transfektionsmedium von der 96-Well-Platte und waschen Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen 50 Mikroliter frische Stimulationslösung hinzufügen. Um die GloSensor cAMP Reagenzlösung zu verdünnen, pipette 2,75 Milliliter der Stimulationslösung in ein Fünf-Milliliter-Rohr und 75 Mikroliter der cAMP-Reagenzlösung hinzufügen. Entfernen Sie die Stimulationslösung aus den Brunnen und fügen Sie jedem Brunnen 25 Mikroliter verdünnte cAMP-Reagenzlösung hinzu.
Die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur in einer dunklen und geruchsfreien Umgebung zwei Stunden lang bebrüten. Zuerst das Geruchsacetophenon auf 1% in 10 Milliliter Mineralöl verdünnen und die Röhre kappen. Vor dem Ende der cAMP-Reagenz-Inkubationszeit 25 Mikroliter der Geruchslösung in eine neue 96-Well-Platte geben.
Legen Sie dann diese Geruchsplatte für fünf Minuten in die Leuchtkraftkammer, um die Kammer mit flüchtigen Geruchsmolekülen auszustatten. Stellen Sie das Luminometer so ein, dass die Lumineszenz bei 20 Zyklen der 90-Sekunden-Plattenmessung mit 0,7 Sekunden Intervall zwischen den Zyklen mit null Sekunden Verzögerung aufzeichnet wird. Kurz vor dem Lesen der Platte, entfernen Sie die Geruchsplatte aus der Kammer.
In der 96-Well-Platte, die die transfizierten Zellen enthält, fügen Sie 25 Mikroliter Geruchsmittel in den Raum zwischen den Brunnen, und legen Sie die Platte schnell wieder in die Kammer. Starten Sie die Lumineszenzmessung aller Brunnen für 20 Zyklen innerhalb von 30 Minuten. Entfernen Sie nach der Lumineszenzmessung das restliche Geruchsmittel im Luminometer, indem Sie Diebesstoffe in der Lesekammer mindestens zwei Stunden lang ausgiebig saugen.
Ersetzen Sie dies durch frische Luft, indem Sie druckluftfür fünf Minuten Druckluft senden, bevor Sie das nächste Geruchsmittel inkubieren, um eine Kreuzkontamination von Geruchsflüchtigen zu vermeiden. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, exportieren Sie die Daten aus der Luminometer-Software. Durchschnittlichdie Replikationen desselben ODER für jede Aufnahmezeit.
Um die normalisierte ODER-Antwort auf ein beliebiges Steuerelement zu berechnen, dividieren Sie den leeren Vektor-Gemitteltenwert zu jeder Aufzeichnungszeit in den OR-gemittelten Wert. Normalisieren Sie jede ODER-Antwort auf ihre Basalaktivität, indem Sie die gemittelte ODER-Antwort auf null Sekunden auf jede Aufzeichnungszeitantwort dividieren. Um einen einzelnen OR-Antwortwert für die Kurve jedes ODER zu erhalten, summieren Sie alle Lumineszenzwerte jeder Aufnahmezeit für jeden ODER, um den Bereich unter der Kurve zu erhalten.
In diesem Experiment wurde die Echtzeitaktivierung von Öst-O-Werten von Mäusen auf Dampfgeruchsreize über 20 Messzyklen überwacht. Eine leere Vektorsteuerung wurde verwendet, um sicherzustellen, dass die geruchsinduzierten Aktivitäten der getesteten ORs spezifisch waren. Die Daten für jeden Brunnen wurden zunächst auf den leeren Vektorsteuerungs-Durchschnittswert für jeden Zyklus normalisiert.
Um dann verschiedene ORs-Antworten zu vergleichen, wurden die Daten in diesem Test auf die OR-Ebenen der Basalaktivität normalisiert. Die Einzelaktivierungswerte für jeden ODER wurden berechnet, indem die Fläche unter der Kurve für jeden ODER berechnet wurde, indem die Emissionswerte aller Messzyklen summiert wurden. Zusätzlich können dosisabhängige Reaktionen mit steigenden Geruchsdosen gemessen werden.
Die Reaktion von Olfr1377 auf Acetophenonstimulation in fünf Konzentrationen wurde aufgezeichnet. Nur die drei höheren Konzentrationen konnten Olfr1377 aktivieren. Die reine zusammengesetzte Stimulation zeigt eine Tendenz, die OR-Reaktion im Laufe der Zeit zu verringern, wahrscheinlich aufgrund der Zelltoxizität.
Während des Schritts sollten Sie das verdünnte Geruchsmittel zwischen dem Brunnen hinzufügen und bereit sein, schnell mit der Aufnahme der Platte zu beginnen. Die Zeit zwischen Geruchszugabe und Überwachung sollte minimiert und zwischen zwei Experimenten konstant bleiben. In Vorhöfen sind Zellen biogefährliches Material, so erinnern Sie daran, die Zellen in den entsprechenden Apotheken zu entsorgen.
