Protokolümüz, koku reseptörlerinden oluşan bir panel ile uçucu kokuların saptanmasını ve ayrımcılığını ölçmeyi sağlar. Bu yöntem koku reseptör tabanlı biyosensörler geliştirme imkanını açar. Bu teknik, buhar fazında koku molekülleri üzerine odorant reseptör aktivasyonunun gerçek zamanlı in vitro olarak izlenmesini sağlar.
Bu in vitro ve in vivo yaklaşımlar arasındaki boşluğu doldurur. Bu yöntem, mukozal metabolik enzimlerin rolü de dahil olmak üzere koku algısına yol açan olayların kinetik lerini anlamak için kullanılabilir. Başlamak için, el yazmasına göre M10 ve M10 PSF'yi hazırlayın.
Hücreler 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit M10 PSF 10 mililitre kültürlü. Bir faz kontrast mikroskobu altında kültür çanak gözlemleyin. %100 birleştiğinde, medyayı aspire ederek ve hücreleri 10 mililitre PBS ile hafifçe yıkayarak hücreleri daha düşük bir konsantrasyona bölün.
Sonra PBS aspire ve tripsin-EDTA üç mililitre ekleyin. Hücreler çanak kopana kadar yaklaşık bir dakika tepki versin. Tripsini inaktive etmek için beş mililitre M10 ekleyin ve çanağa bağlı hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipet.
Sekiz mililitre hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü 200-kat-G'de beş dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire ve herhangi bir hücre kütlesi kırmak için yukarı ve aşağı borulama tarafından M10 PSF beş mililitre hücreleri yeniden askıya. Tüp kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
Hücrelerin %20'sini elde etmek için, yeni 1,000 milimetrelik hücre kültürü yemeğine dokuz mililitre M10 PSF ekleyin ve yeniden askıya alınan hücre çözeltisinin bir mililitresini aktarın. 37 santigrat derecede kuluçka ve %5 karbondioksit. Bu çanak, % 20 birleştiğinde oturan, 48 saat içinde% 100 birleştiği nde ulaşacaktır.
Gözlemlemek için bir faz kontrast mikroskobu altında çanak yerleştirin. 100% hücre birleştirme kültür çanak 1/10 atın. Ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre PBS ile nazikçe yıkayın.
Daha sonra hücreleri tripsin-EDTA ve M10, santrifüj ile tedavi edin ve daha önce yapıldığı gibi M10 PSF ile tekrar tedavi edin. Bir 96-iyi plaka gerçekleştirmek için, taze M10 PSF 5.5 mililitre resuspended hücrelerin beş mililitre 500 mikrolitre ekleyin. Hava kabarcıkları üretmeden hücreleri ve M10 PSF karıştırın.
Pipet 50 mikrolitre seyreltilmiş askıda hücrelerin her bir kuyuya 96 kuyulu bir pipet kullanarak. Bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuluçkaya yat. İlk olarak, bir faz kontrast mikroskobu altında bir gecede kültürlü 96-iyi plaka yerleştirin, hücre birleşimi gözlemlemek ve% 30 ve% 50 arasında olduğundan emin olun 1.5 mililitrelik bir tüp içinde ilk transfeksiyon karışımı hazırlayın 1.5 mililitrelik bir tüp içinde tüm plaka için ortak plazmidler el yazmasına göre.
Rho-pCi boş vektör negatif kontrol, ve Olfr1377 test odorant aseton yanıt bilinen olumlu bir kontrol. Karışımı kontrol plazmidlerinden birini içeren iki transfeksiyon karışımına bölün. 500 mikrolitre MEM ve 20 mikrolitre lipofektamin 2000 reaktif içeren ikinci bir transfeksiyon karışımı hazırlayın.
Her rezervuar iyi ikinci karışımın yarısını ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı boru lama tarafından karıştırın. Tüpoda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatın. Bir 96-iyi plaka için M10 beş mililitre ekleyin.
Her rezervuar içine 2,5 mililitre iyi ekleyin ve yavaşça karıştırın. M10 PSF'yi daha önce kaplanmış 96 kuyulu plakadaki son transfeksiyon ortamının 50 mikrolitresiyle değiştirin. Bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuluçkaya yat.
Daha sonra luminometrenin kapısını açın ve vakum pompasına bağlı tüpü takın. Bir gecede luminometre nin haznesini vakumla. Transfeksiyondan sonra, %60 ile %100 arasında bir hücre birleşimini sağlamak için 96 kuyulu plakayı faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin Hank'in 10 milimolar HEPES ve beş milimolar D-glukoz içeren Dengeli Tuz Çözeltisinin stimülasyon çözeltisini hazırlayın.
Transfeksiyon ortamını 96 kuyulu plakadan çıkarın ve her kuyuya 50 mikrolitre taze stimülasyon çözeltisi ekleyerek hücreleri yıkayın. GloSensor cAMP reaktif çözeltisini seyreltmek için, stimülasyon çözeltisinin 2,75 mililitrelik pipeti beş mililitrelik bir tüpe ve cAMP reaktif çözeltisinin 75 mikrolitresini ekleyin. Kuyulardan stimülasyon çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 25 mikrolitre seyreltilmiş cAMP reaktif çözeltisi ekleyin.
96 kuyulu plakayı karanlık ve kokusuz bir ortamda oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın. İlk olarak, mineral yağ 10 mililitre içinde% 1 odorant astofenon seyreltin ve tüp kapağı. CAMP reaktif kuluçka süresi nin bitiminden önce, her kuyuya 96 kuyulu yeni bir plaka içinde 25 mikrolitre koku çözeltisi ekleyin.
Daha sonra bu koku tabakasını, uçucu koku molekülleri ile odayı dengelemek için beş dakika boyunca luminometre odasına yerleştirin. Luminometreyi, döngüler arasında 0,7 saniyelik aralıkla 90 saniyelik plaka ölçümünün 20 döngüsü boyunca sıfır saniyegecikmeyle parlaklık kaydedin. Tabağı okumadan hemen önce, haznedeki hazneyi çıkarın.
Transfected hücreleri içeren 96-iyi plaka, kuyular arasındaki boşlukta koku 25 mikrolitre ekleyin ve hızlı bir şekilde odasına plaka geri koymak. 30 dakika içinde 20 döngü için tüm kuyuların parlaklık ölçümü başlatın. Parlaklık ölçümünden sonra, luminometrenin içindeki kalan kokuyu, okuma odasındaki kokuları en az iki saat boyunca vakumlayarak çıkarın.
Koku uçucularının çapraz kontaminasyonunu önlemek için bir sonraki kokuyu kuluçkaya yatırmadan önce beş dakika basınçlı hava göndererek temiz hava ile değiştirin. Veri analizine başlamak için, luminometre yazılımındaki verileri dışa aktarın. Her kayıt zamanı için aynı OR'un kopyalarını ortalaman.
Herhangi bir nihai denetime normalleştirilmiş OR yanıtını hesaplamak için, boş vektör ortalaması değeri her kayıt zamanında OR ortalaması değerine bölün. Ortalama OR yanıtını her kayıt süresi yanıtına sıfır saniyede bölerek her BIR OR yanıtını bazal aktivitelerine normalleştirin. Her OR'un eğrisi için tek bir OR yanıt değeri elde etmek için, eğrinin altındaki alanı elde etmek için her veya kayıt zamanının tüm parlaklık değerlerini toplar.
Bu deneyde, fare lerin buhar koku verici stimülasyonu üzerine gerçek zamanlı aktivasyonu 20 ölçüm döngüsü nde izlendi. Test edilen OR'lerin koku kaynaklı aktivitelerinin spesifik olduğundan emin olmak için boş bir vektör kontrolü kullanıldı. Her kuyunun verileri ilk olarak her çevrim için boş vektör kontrolü ortalaması değerine normalleştirildi.
Daha sonra, farklı ORs'lerinin yanıtlarını karşılaştırmak için, veriler bu testteki bazal aktivitenin OR düzeylerine göre normalleştirildi. Her OR için tek aktivasyon değerleri, tüm ölçüm döngülerinin emisyon değerleri toplanarak her veya her biri için eğrinin altındaki alan hesaplanarak hesaplandı. Ayrıca, doza bağlı yanıtlar artan koku dozları kullanılarak ölçülebilir.
Olfr1377'nin beş konsantrasyonda asetik uyarıma yanıtı kaydedildi. Sadece üç yüksek konsantrasyon Olfr1377'yi aktive edebildi. Saf bileşik stimülasyon zaman içinde OR tepkisini azaltmak için bir eğilim gösterir, muhtemelen hücre toksisitesi nedeniyle.
Adım sırasında, kuyu arasında seyreltilmiş odorant eklemeniz gerekir, ve hızlı bir şekilde plaka kaydı başlatmak için hazır olun. Koku ilavesi ile izleme arasındaki süre en aza indirilmeli ve iki deney arasında sabit olmalıdır. Atria hücrelerinde biyolojik olarak tehlikeli madde vardır, bu yüzden hücreleri uygun dispanserlere atmayı hatırlatın.
