بروتوكول لدينا تمكن من قياس الكشف عن والتمييز من الروائح المتقلبة مع لوحة من مستقبلات الرائحة. هذه الطريقة تفتح إمكانية تطوير biosensors القائمة على مستقبلات الرائحة. هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي في المختبر الرصد من تنشيط مستقبلات الرائحة على جزيئات ذات رائحة في مرحلة البخار.
أنه يسد الفجوة بين في المختبر وفي في النهج. يمكن استخدام هذه الطريقة لفهم حركية الأحداث التي تؤدي إلى إدراك الرائحة ، بما في ذلك دور الإنزيمات الأيضية المخاطية. للبدء، قم بإعداد M10 و M10 PSF وفقًا للمخطوطة.
وتزرع الخلايا في 10 ملليلتر من M10 PSF في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مراقبة طبق الثقافة تحت مجهر النقيض مرحلة. عندما تصل إلى 100٪ التقاء، وتقسيم الخلايا إلى تركيز أقل عن طريق التعرق وسائل الإعلام وغسل الخلايا بلطف مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
ثم التعرق في برنامج تلفزيوني وإضافة ثلاثة ملليلترات من التربسين EDTA. السماح لها تتفاعل لمدة دقيقة واحدة تقريبا حتى الخلايا تنفصل عن الطبق. إضافة خمسة ملليلتر من M10 إلى تعطيل التربسين، وماصة صعودا وهبوطا لفصل الخلايا المرفقة إلى الطبق.
نقل ثمانية ملليلتر من تعليق الخلية من الطبق إلى أنبوب 15 ملليلتر، والطرد المركزي الأنبوب في 200-G لمدة خمس دقائق. التعرق وssuspend الخلايا في خمسة ملليلتر من PSF M10 عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لتفريق أي كتلة الخلية. تجنب خلق فقاعات في أنبوب.
للحصول على التقاء 20٪ من الخلايا، أضف تسعة ملليلترات من M10 PSF في طبق جديد لثقافة الخلايا 1، 000 ملليمتر، ونقل ملليلتر واحد من محلول الخلية resuspended. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. هذا الطبق، يجلس في التقاء 20٪، وسوف تصل إلى 100٪ التقاء في 48 ساعة.
ضع الطبق تحت مجهر النقيض من المرحلة لمراقبة. اتخاذ 1/10 من 100٪ طبق ثقافة التقاء الخلية. التعرق وسائل الإعلام وغسل الخلايا بلطف مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
ثم تعامل الخلايا مع التربسين-EDTA وM10، والطرد المركزي، وعلاج مرة أخرى مع M10 PSF كما أجريت سابقا. لتحقيق واحد 96 جيدا لوحة، إضافة 500 ميكرولترات من خمسة ملليلتر من الخلايا resuspended إلى 5.5 ملليلتر من M10 PSF الطازجة. مزيج الخلايا وM10 PSF دون توليد فقاعات الهواء.
Pipette 50 ميكرولترات من الخلايا المعلقة المخففة في كل بئر من لوحة 96-جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أولاً، ضع لوحة 96 بئرًا مثقفة بين عشية وضحاها تحت مجهر تباين المرحلة، وارصد التقاء الخلايا، وتأكد من أنها بين 30٪ و50٪ أعد مزيجًا أولًا من عملية نقل في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على البلازميدات الشائعة في اللوحة بأكملها وفقًا للمخطوطة.
Rho-pCi هو تحكم سلبي فارغ ناقل، وOlfr1377 هو عنصر تحكم إيجابي معروف للاستجابة إلى الأستوبينون المُختبر. تقسيم المزيج إلى اثنين من يمزج transfection التي تحتوي على واحد من plasmids التحكم. إعداد مزيج الثانية transfection تحتوي على 500 ميكرولترات من MEM و 20 ميكرولترات من يبوفكتامين 2000 كاشف.
إضافة نصف المزيج الثاني إلى كل خزان جيدا ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. احتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة خمسة ملليلتر من M10 لطبقة واحدة 96-well.
إضافة 2.5 ملليلتر في كل خزان جيدا ويخلط بلطف. استبدل M10 PSF في اللوحة ذات الـ96 بئرًا المطلية سابقًا بـ 50 ميكرولترات من وسائط النقل النهائية. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
ثم افتح باب المضيء وأدخل الأنبوب المتصل بمضخة الفراغ. فراغ غرفة من المضيء بين عشية وضحاها. بعد transfection، لاحظ لوحة 96-جيدا تحت المجهر النقيض مرحلة لضمان التقاء الخلايا بين 60٪ و 100٪ إعداد حل التحفيز من حل الملح المتوازن هانك التي تحتوي على 10 ملليمولار من HEPES وخمسة ملليمولار من د-جلوكوز.
إزالة المتوسطة transfection من لوحة 96-جيدا وغسل الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من محلول التحفيز الطازج لكل بئر. لتخفيف محلول كاشف cAMP GloSensor، فإن ماصة 2.75 ملليلتر من محلول التحفيز إلى أنبوب من خمسة ملليلتر وإضافة 75 ميكرولترات من محلول الكواشف cAMP. إزالة حل التحفيز من الآبار، وإضافة 25 ميكرولترات من محلول كاشف cAMP المخفف لكل بئر.
احتضان لوحة 96-well في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة وخالية من الرائحة لمدة ساعتين. أولاً، تمييع الأسيتوبينون المُعَد إلى 1٪ في 10 ملليلترات من الزيت المعدني وسقف الأنبوب. قبل نهاية وقت الحضانة cAMP، إضافة 25 ميكرولترات من الحل رائحة لكل بئر في لوحة جديدة 96-جيدا.
ثم ضع هذه اللوحة ذات الرائحة في غرفة المضيء لمدة خمس دقائق لتكبيل الغرفة بجزيئات ذات رائحة متطايرة. تعيين مضيئة لتسجيل الإنارة مع ثواني الصفر من التأخير خلال 20 دورة من قياس لوحة 90 ثانية، مع 0.7 ثانية من الفاصل بين الدورات. الحق قبل قراءة لوحة، وإزالة لوحة رائحة من الغرفة.
في لوحة 96-well التي تحتوي على الخلايا المصابة، إضافة 25 ميكرولترات من رائحة في الفضاء بين الآبار، وسرعان ما وضع لوحة مرة أخرى إلى الغرفة. ابدأ قياس الإنارة لجميع الآبار لمدة 20 دورة في غضون 30 دقيقة. بعد قياس الإضاءة، قم بإزالة الرائحة المتبقية داخل المضيء عن طريق كنس الروائح في غرفة القراءة على نطاق واسع لمدة ساعتين على الأقل.
استبدال مع الهواء النقي عن طريق إرسال الهواء المضغوط لمدة خمس دقائق قبل احتضان رائحة المقبل لتجنب التلوث المتبادل من المواد المتطايرة رائحة. لبدء تحليل البيانات، قم بتصدير البيانات من برنامج المضيءميتر. متوسط النسخ المتماثلة لنفس أو لكل وقت تسجيل.
لحساب استجابة OR التي تم تسويتها إلى أي عنصر تحكم في نهاية المطاف، قم بتقسيم قيمة متوسطة المتجهات الفارغة إلى قيمة OR-averaged في كل وقت تسجيل. تطبيع كل استجابة OR إلى النشاط القاعدي عن طريق تقسيم متوسط أو استجابة في صفر ثانية لكل رد وقت التسجيل. للحصول على قيمة استجابة OR واحدة لمنحنى كل أو، قم بتلخيص كافة قيم الإضاءة لكل وقت تسجيل لكل أو لكي تحصل على المساحة تحت المنحنى.
في هذه التجربة، تم رصد التنشيط في الوقت الحقيقي من الفئران ORs على حافز بخار الرائحة أكثر من 20 دورات القياس. واستُخدمت مكافحة ناقلات فارغة لضمان أن الأنشطة التي يسببها الروائح التي تُجرى في الموارد الخارجية التي تم اختبارها محددة. تم أولاً تطبيع البيانات لكل بئر إلى قيمة معدل معدل مكافحة النواقل الفارغة لكل دورة.
ثم، لمقارنة ردود ORs',مختلفة، تم تطبيع البيانات إلى مستويات OR النشاط القاعدي في هذا الفحص. وقد حسبت قيم التفعيل الواحد لكل وحدة من الفئات عن طريق حساب المساحة تحت المنحنى لكل أو من هذه العمليات عن طريق جمع قيم الانبعاثات في جميع دورات القياس. بالإضافة إلى ذلك, يمكن قياس الاستجابات تعتمد على الجرعة باستخدام جرعات ذات رائحة متزايدة.
تم تسجيل استجابة Olfr1377 لتحفيز الأسيتوفينون في خمسة تركيزات. فقط التركيزات الثلاثة الأعلى كانت قادرة على تنشيط Olfr1377. يظهر التحفيز المركب النقي ميلًا إلى تقليل استجابة OR بمرور الوقت ، على الأرجح بسبب سمية الخلية.
خلال هذه الخطوة، يجب إضافة رائحة المخفف بين البئر، وتكون على استعداد للبدء بسرعة تسجيل لوحة. وينبغي التقليل من الوقت بين إضافة الرائحة والرصد وثابت بين تجربتين. في الخلايا الأذينة هي المواد الحية الخطر، لذلك أذكر للتخلص من الخلايا في المستوصفات المناسبة.
