Наш протокол позволяет измерять обнаружение и дискриминацию летучих запахов с помощью панели рецепторов одоранта. Этот метод открывает возможность разработки биосенсоров на основе рецепторов одора. Этот метод позволяет в режиме реального времени в пробирке мониторинга активации рецепторов запаха на молекулы запаха в фазе пара.
Он заполняет пробел между подходами in vitro и in vivo. Этот метод может быть использован для понимания кинетики событий, которые приводят к восприятию запаха, в том числе роль слизистых метаболических ферментов. Для начала подготовьтесь к M10 и M10 PSF согласно рукописи.
Клетки культурированы в 10 миллилитров M10 PSF при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе. Наблюдайте за культурным блюдом под фазовой контрастной микроскопом. Когда он достигнет 100% слияния, разделить клетки на более низкую концентрацию, аспирируя средства массовой информации и мыть клетки мягко с 10 миллилитров PBS.
Затем аспирировать PBS и добавить три миллилитров трипсина-EDTA. Пусть он реагирует в течение примерно одной минуты, пока клетки отмежеваться от блюда. Добавить пять миллилитров M10 для инактивации трипсина, и пипетки вверх и вниз, чтобы отделить клетки, прикрепленные к блюду.
Перенесите восемь миллилитров клеточной суспензии из блюда в 15-миллилитровую трубку и центрифугировать трубку при 200-кратной Г в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно использовать клетки в пяти миллилитров M10 PSF путем трубопроводов вверх и вниз, чтобы разбить любую массу клеток. Избегайте создания пузырьков в трубке.
Чтобы получить 20%-ное слияние клеток, добавьте девять миллилитров M10 PSF в новое 1000-миллиметровое блюдо клеточной культуры и перенесите один миллилитр повторного клеточного раствора. Инкубация при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. Это блюдо, сидящее при 20%-м слиянии, достигнет 100% слияния в течение 48 часов.
Поместите блюдо под фазовый контрастный микроскоп для наблюдения. Возьмите 1/10 из 100%-клеточных культур слияния блюдо. Аспирировать средства массовой информации и мыть клетки осторожно с 10 миллилитров PBS.
Затем лечить клетки с трипсином-ЭДТА и M10, центрифуга, и лечить снова с M10 PSF, как это было ранее выполнено. Чтобы реализовать одну пластину из 96-колодец, добавьте 500 микролитров из пяти миллилитров повторно натраченных клеток в 5,5 миллилитров свежих M10 PSF. Смешайте клетки и M10 PSF без генерации пузырьков воздуха.
Pipette 50 микролитров разбавленных подвесных клеток в каждую колодец 96-ну пластины с помощью многоканальной пипетки. Инкубация на ночь при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Во-первых, поместите 96-хорошо пластины культурных ночь под фазовой контрастной микроскоп, наблюдать слияние клеток, и убедитесь, что это между 30%и 50%Подготовка первой трансфекции смесь в 1,5-миллилитровой трубки, которая содержит плазмиды, общие для всей пластины в соответствии с рукописью.
Rho-pCi является пустым вектором отрицательного контроля, и Olfr1377 является положительным контролем, как известно, реагировать на испытанный ацетофенон. Разделите смесь на две трансфектные смеси, содержащие одну из контрольных плазмидов. Приготовьте вторую смесь трансфекции, содержащую 500 микролитров MEM и 20 микролитров реагента липофектамина 2000 года.
Добавить половину второй смеси в каждый резервуар хорошо и осторожно перемешать путем трубопроводов вверх и вниз. Инкубировать трубку в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавьте пять миллилитров M10 для одной пластины из 96 колодец.
Добавить 2,5 миллилитров в каждый резервуар хорошо и аккуратно перемешать. Замените M10 PSF на ранее поцараженной пластине 96-колодец с 50 микролитров конечных трансфектных средств массовой информации. Инкубация на ночь при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе.
Затем откройте дверь люминометра и вставьте трубку, соединенную с вакуумным насосом. Вакуум камеры люминометра на ночь. После трансфекции, наблюдать 96-хорошо пластины под фазовым контрастным микроскопом, чтобы обеспечить слияние клеток между 60%и 100% Подготовка стимуляции раствор сбалансированного раствора соли Хэнка, содержащего 10-миллимоляра HEPES и пять миллимоляра D-глюкозы.
Удалить трансфекции среды из 96-хорошо пластины и мыть клетки, добавив 50 микролитров свежего раствора стимуляции для каждой хорошо. Чтобы разбавить раствор реагентов GloSensor cAMP, пипетка 2,75 миллилитров раствора стимуляции в пятими миллилитровую трубку и добавить 75 микролитров раствора реагентов CAMP. Удалите раствор стимуляции из скважин и добавьте 25 микролитров разбавленного раствора реагентов CAMP к каждой скважине.
Инкубировать 96-хорошо пластины при комнатной температуре в темной и без запаха окружающей среды в течение двух часов. Во-первых, разбавить пахант ацетофенон до 1%в 10 миллилитров минерального масла и крышка трубки. До окончания времени инкубации реагентов CAMP добавьте 25 микролитров раствора одоранта к каждой пластине в новой пластине 96-колодец.
Затем поместите эту одорантную пластину в камеру люминометра в течение пяти минут, чтобы уравночные камеры с летучими молекулами одоранта. Установите люминометр для записи люминесценции с нулевой задержкой секунд в течение 20 циклов 90-секундного измерения пластины, с интервалом 0,7 секунды между циклами. Прямо перед чтением пластины, удалить одорант пластины из камеры.
В пластине 96 скважин, содержащей трансфицированные клетки, добавьте 25 микролитров одоранта в пространство между колодцами и быстро поместите пластину обратно в камеру. Начните измерение люминесценции всех скважин в течение 20 циклов в течение 30 минут. После измерения люминесценции удалите оставшийся одорант внутри люминометра, пылесосив одоранты в камере чтения в течение по крайней мере двух часов.
Заменить свежим воздухом, отправив сжатый воздух в течение пяти минут, прежде чем инкубировать следующий запах, чтобы избежать перекрестного загрязнения летучих веществ запаха. Чтобы начать анализ данных, экспорт данных из люминометра программного обеспечения. Средние репликации одного и того же OR для каждого времени записи.
Чтобы рассчитать нормализованный ответ OR на любой возможный контроль, разделите пустое векторное среднее значение на значение OR-усредняемое при каждом времени записи. Нормализация каждого ответа ИЛИ на их базальную активность путем деления усредного ответа ИЛИ на ноль секунд к каждому ответу времени записи. Чтобы получить единое значение ответа OR для кривой каждой или или, сумма всех значений люминесценции каждого времени записи для каждого или для того, чтобы получить область под кривой.
В этом эксперименте, в режиме реального времени активации мышей ORs на паровой одорант стимул был проверен в течение 20 циклов измерения. Для обеспечения того, чтобы деятельность проверенных ОР, вызванная запахом, была специфической, использовалась пустая борьба с переносчиками. Данные по каждой из колодец были сначала нормализованы до пустого значения контроля вектора для каждого цикла.
Затем, чтобы сравнить различные ORs'ответы, данные были нормализовывались до уровня OR базальной активности в этом анализе. Значения одной активации для каждой ОР вычислялись путем расчета области под кривой для каждой ИЛИ путем суммирования значений выбросов всех циклов измерений. Кроме того, зависит от дозы ответы могут быть измерены с помощью увеличения дозы одоранта.
Зафиксирована реакция Olfr1377 на стимуляцию ацетофенона в пяти концентрациях. Только три более высокие концентрации смогли активировать Olfr1377. Чистая стимуляция соединения показывает тенденцию к снижению реакции ИЛИ с течением времени, вероятно, из-за токсичности клеток.
Во время шага, вы должны добавить разбавленный запах между хорошо, и быть готовым, чтобы начать быстро запись пластины. Время между добавлением одоранта и мониторингом должно быть сведено к минимуму и постоянно между двумя экспериментами. В клетках атрии находятся биоопасные материалы, поэтому напоминаем утилизировать клетки в соответствующих диспансерах.
