Nuestro protocolo permite medir la detección y discriminación de olores volátiles con un panel de receptores de olores. Este método abre la posibilidad de desarrollar biosensores basados en receptores de olores. Esta técnica permite el monitoreo in vitro en tiempo real de la activación del receptor de olores sobre moléculas de olor en fase de vapor.
Llena el vacío entre los enfoques in vitro e in vivo. Este método se puede utilizar para entender la cinética de los eventos que conducen a la percepción del olor, incluyendo el papel de las enzimas metabólicas mucosas. Para empezar, prepare M10 y M10 PSF de acuerdo con el manuscrito.
Las células se cultivan en 10 mililitros de PSF M10 a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Observe el plato de cultivo bajo un microscopio de contraste de fase. Cuando alcance el 100% de confluencia, divida las células a una concentración más baja aspirando los medios y lavando las células suavemente con 10 mililitros de PBS.
A continuación, aspirar el PBS y añadir tres mililitros de trippsina-EDTA. Dejar reaccionar durante aproximadamente un minuto hasta que las células se disocien del plato. Agregue cinco mililitros de M10 para inactivar la trippsina, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para separar las celdas unidas al plato.
Transfiera los ocho mililitros de suspensión celular de la placa a un tubo de 15 mililitros, y centrifuga el tubo a 200 veces-G durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en cinco mililitros de PSF M10 pipeteando hacia arriba y hacia abajo para descomponer cualquier masa celular. Evite crear burbujas en el tubo.
Para obtener un 20% de confluencia de células, agregue nueve mililitros de PSF M10 en un nuevo plato de cultivo celular de 1.000 milímetros, y transfiera un mililitro de la solución celular resuspendida. Incubar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Este plato, sentado al 20% de confluencia, alcanzará el 100% de confluencia en 48 horas.
Coloque el plato bajo un microscopio de contraste de fase para observar. Tome 1/10 del plato de cultivo de confluencia de 100% celda. Aspirar los medios y lavar las células suavemente con 10 mililitros de PBS.
Luego trate las células con tripina-EDTA y M10, centrífuga, y trate de nuevo con M10 PSF como se realizó anteriormente. Para realizar una placa de 96 pozos, agregue 500 microlitros de los cinco mililitros de células resuspendidas a 5,5 mililitros de PSF M10 fresco.
Pipeta 50 microlitros de las células suspendidas diluidas en cada pozo de la placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. En primer lugar, coloque la placa de 96 pocillos cultivada durante la noche bajo un microscopio de contraste de fase, observe la confluencia celular y asegúrese de que esté entre el 30% y el 50%Prepare una primera mezcla de transfección en un tubo de 1,5 mililitros que contenga los plásmidos comunes a toda la placa según el manuscrito.
Rho-pCi es un control negativo de vector vacío, y Olfr1377 es un control positivo conocido para responder a la acetofenona de olor probado. Divida la mezcla en dos mezclas de transfección que contengan uno de los plásmidos de control. Preparar una segunda mezcla de transfección que contenga 500 microlitros de MEM y 20 microlitros de lipofectamina 2000 reactivo.
Agregue la mitad de la segunda mezcla a cada pozo de embalse y mezcle suavemente en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar el tubo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agregue cinco mililitros de M10 para una placa de 96 pozos.
Agregue 2,5 mililitros en cada pozo de depósito y mezcle suavemente. Sustituya el PSF M10 en la placa de 96 pocillos previamente chapada por 50 microlitros del soporte de transfección final. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
A continuación, abra la puerta del luminómetro e inserte el tubo conectado a la bomba de vacío. Vacíe la cámara del luminómetro durante la noche. Después de la transfección, observe la placa de 96 pocillos bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia celular entre 60% y 100%Preparar la solución de estimulación de la solución de sal equilibrada de Hank que contiene 10 mililitros de HEPES y cinco mililimolares de D-glucosa.
Retire el medio de transfección de la placa de 96 pocillos y lave las células añadiendo 50 microlitros de solución de estimulación fresca a cada pocero. Para diluir la solución de reactivo de campo GloSensor, pipetear 2,75 mililitros de la solución de estimulación en un tubo de cinco mililitros y añadir 75 microlitros de la solución de reactivo de campo. Retire la solución de estimulación de los pozos y agregue 25 microlitros de solución de reactivo de campo diluido a cada pozo.
Incubar la placa de 96 pozos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro y libre de olor durante dos horas. Primero, diluir la acetofenona oloral al 1%en 10 mililitros de aceite mineral y tapar el tubo. Antes del final del tiempo de incubación del reactivo de campo, añadir 25 microlitros de la solución de olor a cada pozo en una nueva placa de 96 pocillos.
A continuación, coloque esta placa de olor en la cámara del luminómetro durante cinco minutos para equilibrar la cámara con moléculas de olor volátiles. Ajuste el luminómetro para registrar la luminiscencia con cero segundos de retardo durante 20 ciclos de medición de placa de 90 segundos, con 0,7 segundos de intervalo entre ciclos. Justo antes de leer la placa, retire la placa de olor de la cámara.
En la placa de 96 pozos que contiene las células trans infectadas, agregue 25 microlitros de olor en el espacio entre los pozos, y vuelva a colocar rápidamente la placa en la cámara. Inicie la medición de luminiscencia de todos los pozos durante 20 ciclos en 30 minutos. Después de la medición de luminiscencia, retire el olor restante dentro del luminómetro aspirando los olorantes en la cámara de lectura extensamente durante al menos dos horas.
Reemplazar con aire fresco enviando aire comprimido durante cinco minutos antes de incubar el siguiente olor para evitar la contaminación cruzada de los olores volátiles. Para iniciar el análisis de datos, exporte los datos desde el software luminómetro. Promedio de las réplicas del mismo OR para cada tiempo de grabación.
Para calcular la respuesta OR normalizada a cualquier control eventual, divida el valor promediado vectorial vacío en el valor promediado de OR en cada momento de grabación. Normalice cada respuesta OR a su actividad basal dividiendo la respuesta OR promediada en cero segundos a cada respuesta de tiempo de grabación. Para obtener un único valor de respuesta OR para la curva de cada quirófano, sume todos los valores de luminiscencia de cada tiempo de grabación para cada quirófano con el fin de obtener el área debajo de la curva.
En este experimento, la activación en tiempo real de los quirófanos ratones sobre el estímulo del olor al vapor se monitorizó durante 20 ciclos de medición. Se utilizó un control vectorial vacío para asegurar que las actividades inducidas por el olor de los quirófanos probados fueran específicas. Los datos de cada pozo se normalizaron primero al valor promediado de control vectorial vacío para cada ciclo.
A continuación, para comparar las diferentes respuestas de quirófanos, los datos se normalizaron a los niveles de OR de actividad basal en este ensayo. Los valores de activación única para cada quirófano se calcularon calculando el área debajo de la curva para cada quirófano sumando los valores de emisión de todos los ciclos de medición. Además, las respuestas dependientes de la dosis se pueden medir utilizando dosis crecientes de olor.
Se registró la respuesta de Olfr1377 a la estimulación de la acetofenona a cinco concentraciones. Sólo las tres concentraciones más altas fueron capaces de activar Olfr1377. La estimulación compuesta pura muestra una tendencia a disminuir la respuesta del quirófano con el tiempo, probablemente debido a la toxicidad celular.
Durante el paso, debe añadir el olor diluido entre el pozo, y estar preparado para iniciar rápidamente la grabación de la placa. El tiempo entre la adición de olores y la supervisión debe ser minimizado y constante entre dos experimentos. En las aurículas las células son material biopeligroso, así que recuerde eliminar las células en los dispensarios apropiados.
