Nosso protocolo permite medir a detecção e a discriminação de odores voláteis com um painel de receptores odorantes. Este método abre a possibilidade de desenvolver biosensores baseados em receptores odorantes. Esta técnica permite o monitoramento in vitro em tempo real da ativação do receptor odonte sobre moléculas odorantes em fase de vapor.
Ele preenche a lacuna entre abordagens in vitro e in vivo. Este método pode ser usado para entender a cinética dos eventos que levam à percepção do odor, incluindo o papel das enzimas metabólicas mucosas. Para começar, prepare M10 e M10 PSF de acordo com o manuscrito.
As células são cultivadas em 10 mililitros de M10 PSF a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Observe o prato de cultura sob um microscópio de contraste de fase. Quando atingir 100% de confluência, divida as células a uma menor concentração aspirando a mídia e lavando as células suavemente com 10 mililitros de PBS.
Em seguida, aspire o PBS e adicione três mililitros de trypsin-EDTA. Deixe-o reagir por aproximadamente um minuto até que as células se dissociem do prato. Adicione cinco mililitros de M10 para inativar a trippsina, e pipeta para cima e para baixo para desacoprar as células ligadas ao prato.
Transfira os oito mililitros de suspensão celular do prato para um tubo de 15 mililitros, e centrifugar o tubo a 200 vezes G por cinco minutos. Aspire o supernasce e resuspenda as células em cinco mililitros de M10 PSF, pipetando para cima e para baixo para quebrar qualquer massa celular. Evite criar bolhas no tubo.
Para obter 20% de confluência de células, adicione nove mililitros de M10 PSF em um novo prato de cultura celular de 1.000 milímetros, e transfira um milímetro da solução celular resuspended. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Este prato, sentado com 20%, atingirá 100% de confluência em 48 horas.
Coloque o prato sob um microscópio de contraste de fase para observar. Pegue 1/10 do prato de cultura de confluência 100% celular. Aspire a mídia e lave as células suavemente com 10 mililitros de PBS.
Em seguida, trate as células com trippsina-EDTA e M10, centrífuga, e trate novamente com M10 PSF como realizado anteriormente. Para realizar uma placa de 96 poços, adicione 500 microliters dos cinco mililitros de células resuspended a 5,5 mililitros de M10 PSF fresco. Misture as células e O PSF M10 sem gerar bolhas de ar.
Pipeta 50 microliters das células suspensas diluídas em cada poço da placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Primeiro, coloque a placa de 96 poços cultivada durante a noite sob um microscópio de contraste de fase, observe a confluência celular e certifique-se de que está entre 30% e 50% Prepare uma primeira mistura de transfecção em um tubo de 1,5 mililitro que contém os plasmídeos comuns a toda a placa de acordo com o manuscrito.
Rho-pCi é um controle negativo de vetor vazio, e Olfr1377 é um controle positivo conhecido por responder à acetofenona odorenada testada. Divida a mistura em duas misturas de transfecção contendo um dos plasmídeos de controle. Prepare uma segunda mistura de transfecção contendo 500 microliters de MEM e 20 microliters de reagente lipofectamina 2000.
Adicione metade da segunda mistura a cada reservatório bem e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Incubar o tubo por 15 minutos em temperatura ambiente. Adicione cinco mililitros de M10 para uma placa de 96 poços.
Adicione 2,5 mililitros em cada poço do reservatório e misture delicadamente. Substitua o PSF M10 na placa de 96 poços anteriormente banhada por 50 microliters da mídia de transfecção final. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, abra a porta do luminômetro e insira o tubo conectado à bomba de vácuo. Aspire a câmara do luminômetro durante a noite. Após a transfecção, observe a placa de 96 poços sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência celular entre 60% e 100% Prepare a solução de estimulação da Solução de Sal Balanceado de Hank contendo 10 milimolar de HEPES e cinco mililitros de D-glicose.
Remova o meio de transfecção da placa de 96 poços e lave as células adicionando 50 microliters de solução de estimulação fresca a cada poço. Para diluir a solução de reagente GloSensor cAMP, pipeta 2,75 mililitros da solução de estimulação em um tubo de cinco mililitros e adicionar 75 microliters da solução de reagente cAMP. Remova a solução de estimulação dos poços e adicione 25 microliters de solução de reagente cAMP diluída a cada poço.
Incubar a placa de 96 poços à temperatura ambiente em um ambiente escuro e livre de odor por duas horas. Primeiro, diluir a acetofenona odonte para 1% em 10 mililitros de óleo mineral e tampar o tubo. Antes do fim do tempo de incubação do reagente cAMP, adicione 25 microliters da solução odoante a cada poço em uma nova placa de 96 poços.
Em seguida, coloque esta placa de odonte na câmara de luminômetro por cinco minutos para equilibrar a câmara com moléculas de odorante volátil. Defina o luminômetro para registrar a luminescência com zero segundos de atraso durante 20 ciclos de medição da placa de 90 segundos, com intervalo de 0,7 segundos entre os ciclos. Antes de ler a placa, retire a placa de odorante da câmara.
Na placa de 96 poços contendo as células transfeinadas, adicione 25 microliters de odonte no espaço entre os poços, e rapidamente coloque a placa de volta na câmara. Inicie a medição de luminescência de todos os poços por 20 ciclos em 30 minutos. Após a medição da luminescência, remova o odorante restante dentro do luminômetro aspirando odores na câmara de leitura extensivamente por pelo menos duas horas.
Substitua com ar fresco enviando ar comprimido por cinco minutos antes de incubar o próximo odor para evitar a contaminação cruzada de voláteis de odor. Para iniciar a análise dos dados, exporte os dados do software luminômetro. Em média, as réplicas do mesmo OR para cada tempo de gravação.
Para calcular a resposta or normalizada a qualquer controle eventual, divida o valor vazio da média vetorial para o valor médio do OR a cada momento de gravação. Normalize cada resposta or à sua atividade basal dividindo a resposta or média em zero segundos para cada resposta de tempo de gravação. Para obter um único valor de resposta OR para a curva de cada OR, soma todos os valores de luminescência de cada tempo de gravação para cada OR, a fim de obter a área sob a curva.
Neste experimento, a ativação em tempo real de ORs de camundongos sobre o estímulo odorante de vapor foi monitorada em mais de 20 ciclos de medição. Um controle de vetorial vazio foi usado para garantir que as atividades induzidas por odonte das RS testadas fossem específicas. Os dados de cada poço foram primeiro normalizados para o valor médio de controle de vetorial vazio para cada ciclo.
Em seguida, para comparar diferentes respostas das ORs, os dados foram normalizados com os níveis de OR de atividade basal neste ensaio. Os valores de ativação única para cada OR foram calculados pelo cálculo da área sob a curva para cada OR, somando os valores de emissão de todos os ciclos de medição. Além disso, as respostas dependentes de dose podem ser medidas usando doses de odorante crescentes.
A resposta de Olfr1377 à estimulação de acetofenona em cinco concentrações foi registrada. Apenas as três concentrações mais altas foram capazes de ativar Olfr1377. A estimulação composta pura mostra uma tendência a diminuir a resposta do OR ao longo do tempo, provavelmente devido à toxicidade celular.
Durante a etapa, você deve adicionar o odorante diluído entre o poço, e estar preparado para iniciar rapidamente a gravação da placa. O tempo entre a adição e o monitoramento deve ser minimizado e constante entre dois experimentos. Nas células atria são material de risco biológico, então lembre-se de descartar as células nos dispensários apropriados.
