השיטות שלנו מתארות דרך פשוטה וחוזרת ללימוד ננוטוקסיות, כגון בחינת סוגי המוות של תאים ובחינת הייצור של מיני חמצן תגובתי. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות הוא פורמט קפדני המאפשר לנו ללמוד את תת-התפוקה של תאים ואת הסוגים השונים ההולכים וגדלים של מוות תאי. שיטת מחקר הבדיקה DHE מאפשרת לנו לזהות ולכומת מיני חמצן תגובתי ואחריו ציטומטריית זרימה, הדמיה מיקרוסקופית בתכנים גבוהים, ועל ידי ניתוח פלואורסצנטי מבוסס מזוגות.
כדי להתחיל, מניחים צינור Eppendorf המכיל חלקיקי תחמוצת אבץ בתסכום מלאי חלקיקי תחמוצת אבץ לתוך sonicator במשך 15 דקות. הכינו חלקיקי תחמוצת אבץ בריכוזים שונים באמצעות מלאי ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ של מיליגרם למיליליטר. ואז, בארון biosafety, זרע MRC5 פיברובלסטים ריאות אנושיות על שלוש צלחות תרבות שש באר בריכוז של אחד פעמים 10 לתאים החמישיים לבא.
דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר יום אחד, לטפל בתאים עם שני מיליליטר של חלקיקי תחמוצת אבץ במשך שמונה שעות, 16 שעות, או 24 שעות. בכל נקודת זמן, לאסוף את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.
לשטוף את כדורי התא פעמיים עם מלוחים מאגר פוספט, ולאחר מכן resuspend התאים עם מאגר כריכה 1X. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של כתם FITC Annexin V בחמישה microliters של כתם DNA פרופידיום יודיד. הדגירה את התאים המוכתמים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
לפני מיון התאים לפי ציטומטריית זרימה, החלק את הדגימות עם 400 מיקרוליטרים נוספים של מאגר איגוד 1X. טבלה של תרשים עמודות בעוצמה החציונית המתקבלת. עכשיו להשתמש פיפטה להוסיף מיליליטר אחד של חלקיקים בריכוזים שונים לתוך בקבוקונים, ואחריו תשעה מיליליטר של מזון זבוב לעשות ריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למיליליטר, 0.25 מיליגרם למיליליטר, או 0.5 מיליגרם לכל חלקיקי תחמוצת אבץ מיליליטר.
פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ביסודיות. אפשר מזון זבוב המכיל חלקיקי תחמוצת אבץ להתקרר לפחות שעתיים עד שלוש שעות לפני השימוש. ואז הרדמה זבובים זכר ונקבה בוגרים בבקבוקון עם פחמן דו חמצני, ולהציג חמישה זבובים זכר וחמש נקבות זבובים לתוך כל בקבוקון במשך חמישה ימים.
אפשר להם להזדווג ולהטיל ביצים על פני השטח של האוכל. לאחר הרדמה, הסר את זבובי ההורים ואפשר לביצים לעבור התפתחות נוספת בטמפרטורת החדר, המורכבת מארבעה שלבים התפתחותיים שונים. שלב עוברי, זחל, כף היד ומבוגרים.
לאחר 72 עד 120 שעות, ביצים טריות מתפתחות לזחלי instar בשליש המאוחר. באמצעות מדפים, לאסוף את הזחלים מקיר הבקבוקונים לניתוחים. באר של צלחת ניתוח עם מדיום ניתוח או PBS, מניחים את הזחלים לתוך הפתרון.
מתחת לסטריאומיקרוסקופ, השתמש בקצה המדפים כדי ליצור חור זעיר, ולשבור את שכבת הקוטיקל של הזחלים. בזהירות לשלוף את הבטן. מניחים את המעיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מדיום Drosophila של שניידר.
הוסיפו מיקרוליטר אחד של הגשושית DHE, והם דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשטוף את המעיים שלוש פעמים באמצעות מדיום של שניידר כל חמש דקות. הר את המעיים על מגלשות זכוכית, ואספקה עם 10 microliters של מדיום הרכבה antifade המכיל DAPI.
לכידת תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקל. כדי למדוד פלואורסצנטיות, ייבא את תמונות הפלואורסצנטיות שנתפסו שנרכשו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלים לתוכנה ImageJ. לחצו על תפריט הניתוח ובחרו להגדיר מידות.
בחר את מדד הפלט, כגון עוצמה משולבת באזור וערך אפור ממוצע. בחר אזור ללא פלואורסצנטיות כדי להגדיר את הרקע. לחץ על מדידה.
יצא את הנתונים לתוך הגיליון האלקטרוני וקבע את הפלואורסצנטיות הכוללת של התאים. בנה תרשים עמודות ובצע ניתוח סטטיסטי. במחקר זה, תאים שטופלו בתחמוצת אבץ ננו-חלקיקים מפגינים אחוז גבוה יותר של תאי R3 מוקדמים או R6 אפופטיים מאוחרים מאשר תאי בקרה R5. מוות תאי נמק היה מסומן על ידי R4. המעיים שחולצו מזחל דרוסופילה חולקו לשלושה תחומים דיסקרטיים ממוצא התפתחותי שונה.
כלומר, ההמשך, מידגוט וההינדגוט. מניית DHE נוטה לפוג די מהר, אז היזהר מפתרון המניות שאתה משתמש בו. לחלופין, אתה יכול לנסות בדיקות אחרות, למשל תא רוש, אשר נועד לזהות את ROS תאיים באותות ירוקים, וזה יותר photostable מאשר DHE.
הפרוטוקול שלנו מספק מתווה כללי לחקר ייצור ROS תאי, וכימות של רמת ROS למחקר nanotoxicity. DMSO ידוע כממס טוב יותר עבור DHE מאשר PBS. עם זאת, DMSO רעיל.
לכן, ברצוני לייעץ למשתמש להגביל את כל התהליך ללימודים ל-30 דקות לכל היותר. הסיבה לכך היא שאתה יכול להתבונן תוצאה חיובית כוזבת כמו DMSO עלול לגרום למוות של תאים.
