רוב הניסויים חוקרים אינטראקציות בין צמחים לחיידקים על ידי התמקדות בקולוניזציה, אך הפרוטוקול שלנו נועד להסתכל הן על קולוניזציה והן על תחזוקה של החיידקים על השורש. אנחנו יכולים לשנות את הניסוי כך שיתאים לחיידקים וצמחים שונים, ואנחנו יכולים אפילו לבדוק חיידקים מרובים בכל צלחת של 24 בארות. כדי להתחיל, השתמש בניקוב חורים רגיל כדי ליצור דיסקים של רשת שינוי מפלסטיק.
לאסוף את הדיסקים במיכל זכוכית, ולכסות באופן רופף. יש לעקר באמצעות מקלעת אוטומטית שנקבעה למחזור יבש של 20 דקות. השתמש פינצטה מעקרת להבה כדי להפיץ כ 40 דיסקי רשת מעוקרים בשכבה אחת על פני השטח של צלחת אגר בינונית צמיחת הצמח מוכן בעבר.
מניחים שני זרעים מעוקרים בעבר במרכז כל רשת. לאטום את הצלחת עם סרט כירורגי, ו דגירה במשך יומיים עד שישה ימים בארבע מעלות צלזיוס בחושך כדי vernalize את הזרעים. לאחר מכן, מניחים את הצלחת בצד אגר למטה בתא גידול הצמח במשך שמונה עד 10 ימים תחת הגדרות קצרות של יום של תשע שעות של אור ב 21 מעלות צלזיוס ו 15 שעות של חושך ב 18 מעלות צלזיוס לנבוט ולגדל שתילים.
מוסיפים מיליליטר אחד של גידול חיידקי בינוני לכל באר של צלחת סטרילית 24 באר. כדי להעביר את השתילים הנבטים המוטמעים בקשת, השתמש במקלפים מעוקרים בלהבה כדי לקלף בעדינות את רשת הכלים המכילה שתילים מונבטים, בגודל שווה ולא ניזוקו למעלה ומחוץ לצלחת הגר. מעבירים צף אחד עם שתילים לכל באר של נוזל צמיחה חיידקי, בצד השורש למטה.
לאחר מכן, חיידקים resuspend גדל לילה על צלחות אגר במדיום צמיחה חיידקי נוזלי. הוסף 10 microliters של השעיה חיידקית לכל באר, למעט בארות שליטה במדיה בלבד, לריכוז סופי של מיליון יחידות יוצרות מושבה של חיידקים לכל באר. כדי לאטום את הצלחת לצמיחה סטרילית, לחץ בזהירות על סרט חדיר לגז על פני הצלחת מבלי לגעת בצד הדביק.
החל לחץ סביב כל אחת מהטבעות שנעשו על ידי בארות כדי להבטיח כי כל באר כבר אטום בנפרד. לאחר מכן, סגור את הצלחת עם מכסה הפלסטיק שלה להתכרבל מעל הסרט חדיר גז. מניחים את הצלחת בתא גידול צמחים על שייקר צלחת מסלולית מוגדר 220 סל"ד, ודגירה במשך 18 שעות באותם תנאים כמו השתילים נבטו במקור.
כדי לשטוף את כל המצופים עם צמחים, להוסיף מיליליטר אחד של מים סטריליים לכל באר של צלחת חדשה 24 באר. מוציאים סרט חדיר לגז מהצלחת עם צמחים, ולהשתמש בממטרים סטריליים כדי להעביר מצופים ל בארות עם מים, ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר מכן, למלא כל באר של צלחת חדשה 24 גם עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחת הצמח.
מעבירים רשת אחת לכל באר, ומכסים באטם חדיר לגז. דגירה במשך 72 שעות על שייקר צלחת מסלולית ב 220 סל"ד בתא צמיחת הצמח. לאחר הדגירה, לשטוף את הצמחים כפי שנעשה בעבר.
לאחר השטיפת, מוציאים את השתילים מהרשת על ידי הנחת מדפים מעוקרים בעדינות מתחת לעלים בצד העלה של רשת. צובטים קלות את הגבעול, ומנענעים את השתילים מעלה ומחוץ לרשת כדי לעקור את השורש מבלי לשבור אותו. כדי להסיר חיידקים מהשורשים הצמחיים, להעביר שתילים מכל רשת לתוך בארות בודדות של לוח sonication 24 באר המכיל מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים.
Sonicate כל הדגימות בתוך הלוח בבת אחת באמצעות sonicator רב תכליתי כמתואר בכתב היד. כדי לכמת את החיידקים, לבצע דילול סדרתי 10-פי של דגימות sonicated במדיום צמיחה חיידקית. מורחים באמצעות גם גם גם גם חום זכוכית סטרילי, ומדגרים בטמפרטורה האופטימלית לחיידקים עד שניתן לספור מושבות בודדות.
כדי לאסוף שורש צמחים שלם, השתמש במדפים כדי להסיר את השתילים מהרשת. לאחר מכן, להעביר כל צמח לשקופית מיקרוסקופ על ידי הצבת קצה השורש על השקופית וגרירתו מן הקצה כדי להגדיר את סומק להפיל עם השקופית, הבטחת שורש ישר עבור ההדמיה הטובה ביותר. הוסף טיפת מים או צמיחת צמחים סטריליים בינוני לכל מדגם כדי לחות ממשקים בין coverslips ושקופיות.
מניחים כיסוי זכוכית ממש מעל כתר השורש ומתחת לעלים לירות כדי למנוע מלוכסן של כיסוי, ולחץ למטה בעדינות. לאחר מכן, תמונה החיידקים באמצעות מסנני העירור /פליטה המתאימים כדי להבדיל חיידקים אחד מהשני ואת שורש הצמח. Pseudomonas simiae, חיידק פלואורסצנטי באופן טבעי, קולואין שורשי thaliana Arabidopsis נשמר על השורש לאחר העברה למדיום צמיחת הצמח.
כתר שורש, באורך בינוני וטיפ מראים פלואורסצנטיות עקב קולוניזציה של סימאיה פסאודומונס. השליטה השלילית ללא חיידקים לא הראתה קולוניזציה. כאשר Pseudomonas simiae על שורשי thaliana Arabidopsis היו לכמת לאחר 18 שעות של קולוניזציה או 72 שעות של תחזוקה, המספר הכולל של יחידות להרכיב מושבה לכל שתיל בכל נקודת זמן הראה רבייה טובה על פני שכפולים ביולוגיים שבוצעו בימים שונים.
חלה עלייה במספר היחידות המרכיבות מושבה לשתיל לאחר 72 שעות במדיום התחזוקה, בהשוואה למספרים שנצפו בנקודת הזמן שלאחר הקולוניזציה של 18 שעות, מה שמצביע על כך שצמיחה פעילה של החיידקים הקולוניים על שורש הצמח התרחשה בשלב התחזוקה. שלושה מינים של חיידקים מבודדים מן thaliana Arabidopsis גדל באדמה טבעית בתנאי מעבדה שימשו כדי לפקח על הקשר של מינים מרובים על שורשי הצמח. הם היו מובחנים בבירור במדיה המכילה X-gal בשל הבדלים במורפולוגיה ובצבע המושבה, שאיפשרו לספור את היחידות יוצרות המושבה לכל שתיל של כל מין ללא בחירה אנטיביוטית, אפילו ב coculture רב מינים.
שלושת המינים האלה של חיידקים היו כל קולוניה ומתוחזקים על השורש, בין אם לבד או ב coculture חיידקי. כל מין הראה מגמות דומות על פני שכפולים ביולוגיים וטכניים שונים, והראה כי פרוטוקול זה יכול לשמש למדידת יחידות יוצרות מושבה יחסיות או כוללות לכל שורש של כל מין. כאשר גדלו לבדם, אף מין בודד לא הראה עלייה משמעותית בשפע בשלב התחזוקה, אך היחידות הכוללות להרכבת המושבה לכל שורש של הקהילה המשולבת גדלו בקובטורות, מה שמצביע על כך שחיידקים אלה אינם אוסרים על קולוניזציה של הזנים האחרים.
השלבים הקשים ביותר הם אלה הדורשים הסרה של צמחים שלמים מדיסקים רשת. להיות סבלני ועדין יעשה את זה אפשרי. אם תאי החיידקים הם פלואורסצנטיים, הדגימות יכולות להיות ממוינות לפי ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את המספרים היחסיים של תאים.
