A maioria dos experimentos estuda interações entre plantas e micróbios focando na colonização, mas nosso protocolo foi projetado para olhar tanto para a colonização quanto para a manutenção das bactérias na raiz. Podemos mudar o experimento para caber diferentes bactérias e plantas, e podemos até testar várias bactérias em cada placa de 24 poços. Para começar, use um perfurador de furo padrão para criar discos de malha plástica.
Colete os discos em um recipiente de vidro e cubra livremente. Esterilize usando uma autoclave definida para um ciclo seco de 20 minutos. Use pinças esterilizadas por chamas para distribuir aproximadamente 40 discos de malha esterilizados em uma única camada através da superfície de placa de ágar média de crescimento vegetal previamente preparada.
Coloque duas sementes previamente esterilizadas no centro de cada malha. Sele a placa com fita cirúrgica, e incubar por dois a seis dias a quatro graus Celsius na escuridão para vernalizar as sementes. Em seguida, coloque a placa do lado do ágar para baixo em uma câmara de crescimento de plantas por oito a 10 dias sob configurações de dia curto de nove horas de luz a 21 graus Celsius e 15 horas de escuro a 18 graus Celsius para germinar e cultivar mudas.
Adicione um mililitro de meio de crescimento bacteriano a cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Para transferir as mudas germinadas embutidas na malha, use fórceps esterilizados por chamas para descascar suavemente a malha contendo duas mudas germinadas, igualmente dimensionadas, e mudas intactas para cima e para fora da placa de ágar. Transfira um carro alegórico com mudas para cada poço de líquido de crescimento bacteriano, lado raiz para baixo.
Em seguida, bactérias resuspend cultivadas durante a noite em placas de ágar em meio de crescimento bacteriano líquido. Adicione 10 microliters de suspensão bacteriana a cada poço, exceto para poços de controle somente de mídia, para uma concentração final de um milhão de unidades formadoras de colônias de bactérias por poço. Para selar a placa para crescimento estéril, pressione cuidadosamente o filme permeável a gás através da placa sem tocar no lado pegajoso.
Aplique pressão em torno de cada um dos anéis feitos pelos poços para garantir que cada poço tenha sido selado individualmente. Em seguida, feche a placa com sua tampa de plástico aconchegante sobre o filme permeável a gás. Coloque a placa em uma câmara de crescimento vegetal em um agitador de placa orbital definido a 220 rpm, e incubar por 18 horas sob as mesmas condições que as mudas foram originalmente germinadas.
Para enxaguar todos os carros alegóricos com plantas, adicione um mililitro de água estéril a cada poço de uma nova placa de 24 poços. Remova o filme permeável a gás da placa com plantas e use fórceps estéreis para transferir boias para poços com água, e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Em seguida, encha cada poço de uma nova placa de 24 poços com um mililitro de meio de crescimento vegetal.
Transfira uma malha para cada poço e cubra com um selo permeável a gás. Incubar por 72 horas no agitador de placa orbital a 220 rpm na câmara de crescimento da planta. Após a incubação, enxágue as plantas como feito anteriormente.
Após a lavagem, remova as mudas da malha colocando suavemente fórceps esterilizados por chamas abaixo das folhas no lado da folha da malha. Belisque levemente a haste, e mexa as mudas para cima e para longe da malha para desalojar a raiz sem quebrá-la. Para remover bactérias das raízes vegetais, transfira as mudas de cada malha para poços individuais de uma placa de sônica de 24 poços contendo um mililitro de água dupla destilada.
Sonicate todas as amostras dentro da placa ao mesmo tempo usando um sônico multifacetado como descrito no manuscrito. Para quantificar as bactérias, realize diluições 10 vezes mais vezes das amostras sonicadas em meio de crescimento bacteriano. Espalhe usando contas de vidro estéreis e incubar na temperatura ideal para bactérias até que colônias individuais sejam contáveis.
Para coletar raízes intactas da planta, use fórceps para remover as mudas da malha. Em seguida, transfira cada planta para um slide de microscópio colocando a ponta da raiz no slide e arrastando-a para longe da ponta para definir o tiro para baixo com o slide, garantindo uma raiz endireitada para melhor imagem. Adicione uma gota de água ou meio de crescimento vegetal estéril a cada amostra para hidratar interfaces entre as tampas e slides.
Coloque uma mancha de vidro logo acima da coroa raiz e abaixo das folhas de ensaio para evitar inclinação da tampa, e pressione suavemente para baixo. Em seguida, imagem as bactérias usando filtros apropriados de excitação/emissão para diferenciar bactérias entre si e a raiz da planta. Pseudomonas simiae, bactéria naturalmente fluorescente, colonizada raízes arabidopsis thaliana e foi mantida na raiz após transferência para o meio de crescimento vegetal.
Coroa radicular, comprimento médio e ponta mostram fluorescência devido à colonização de Pseudomonas simiae. O controle negativo sem bactérias não mostrou colonização. Quando pseudomonas simiae sobre raízes arabidopsis thaliana foram quantificadas após 18 horas de colonização ou 72 horas de manutenção, o número total de unidades formadoras de colônias por muda em ambos os momentos mostrou boa reprodutibilidade através de réplicas biológicas realizadas em dias diferentes.
Houve aumento no número de unidades formadoras de colônias por muda após 72 horas em meio de manutenção, em comparação com os números observados no ponto de tempo pós-colonização de 18 horas, indicando que o crescimento ativo das bactérias colonizadas na raiz da planta ocorreu durante a fase de manutenção. Três espécies de bactérias isoladas de Arabidopsis thaliana cultivadas em solo natural em condições laboratoriais foram utilizadas para monitorar a associação de múltiplas espécies em raízes vegetais. Eles foram claramente diferenciados em meios contendo X-gal devido a diferenças na morfologia e cor das colônias, o que permitiu contar as unidades formadoras de colônias por muda de cada espécie sem seleção de antibióticos, mesmo na cocultura de várias espécies.
Estas três espécies de bactérias foram todas colonizadas e mantidas na raiz, seja sozinhas ou em cocultura bacteriana. Cada espécie mostrou tendências semelhantes em diferentes réplicas biológicas e técnicas, mostrando que este protocolo pode ser usado para medir unidades relativas ou totais de formação de colônias por raiz de cada espécie. Quando cultivadas sozinhas, nenhuma espécie individual apresentou aumento substancial em abundância durante a fase de manutenção, mas as unidades globais de formação de colônias por raiz da comunidade combinada aumentaram em coculturas, indicando que essas bactérias não proíbem a colonização das outras cepas.
Os passos mais difíceis são aqueles que requerem a remoção de plantas intactas dos discos de malha. Ser paciente e gentil tornará isso possível. Se as células bacterianas forem fluorescentes, as amostras podem ser classificadas por citometria de fluxo para determinar o número relativo de células.
